抗ｒｓｖ抗体の組み換え製造のための方法

专利摘要:
本発明は、組み換え抗ＲＳＶ抗体および抗体組成物の製造方法に関する。本方法は、変異体核酸配列の集合でトランスフェクトされた細胞の集合を得ることを含んでなり、集合中の各細胞がトランスフェクトされ、そして１つの個別の抗ＲＳＶ抗体を発現することが可能である。細胞は、抗ＲＳＶ抗体／抗体の発現に適切な条件下で培養される。核酸配列は、部位特異的組み込みを回避する発現ベクターによるトランスフェクションによって細胞に導入される。本方法は、治療用途のための組み換えモノクローナルおよびポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を製造するのに適切である。
公开号:JP2011514139A
申请号:JP2010523277
申请日:2008-09-04
公开日:2011-05-06
发明作者:アンネ・ボンゴー・トルストルップ；フィン・ヴィベルク；ヨハン・ラント；ラース・セゴー・ニールセン
申请人:シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、部位特異的組み込みとは独立した産生系を使用する組み換え抗ＲＳＶ抗体の製造に関する。]
背景技術

[0002] 組み換えポリクローナル抗体は、所望する標的に対する免疫応答を有するドナーから抗体をコードする核酸を単離し、続いて、所望する標的に特異的に結合する抗体をスクリーニングすることによって作製され得る。ポリクローナル抗体は、１つの抗体発現プラスミドの各細胞の同じゲノム部位への部位特異的組み込みに基づく哺乳類発現技術を適応することにより、１つの容器において製造することができ、これは、特許文献１に記載されている。ポリクローナル抗体のこのタイプの１つの例は、Ｒｈｅｓｕｓ Ｄに対する組み換えポリクローナル抗体である（特許文献２）。もう１つの例は、オルソポックスウイルスに対する組み換えポリクローナル抗体である（特許文献３）。部位特異的組み込みを使用すると、各細胞が１つの単一のコピーを含有し、そして発現レベルおよび増殖速度が比較的均一である細胞集団が生じる。]
先行技術

[0003] WO 2004/061104
WO 2006/007850
WO 2007/065433]
課題を解決するための手段

[0004] 本発明は、特定の組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の産生のための別の方法であって、部位特異的組み込みとは独立しており、従って、抗体の多クローン性を維持しながら、細胞系統の選択に関して自由度の高い方法を提供する。加えて、発現レベルは、部位特異的組み込み可能な方法よりも高い可能性がある。]
[0005] 本発明のアプローチは、抗ＲＳＶ抗体をコードする遺伝子の宿主細胞への無作為な組み込み、好ましくは、その後の所望される特徴を伴う安定にトランスフェクトされた単一細胞のクローニングに基づく。次いで、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の産生のためのポリクローナル製造細胞系統を作製するために、それぞれがポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個々のメンバーを産生する個々の細胞クローンを混合する。]
[0006] それ故、第１の態様では、本発明は、細胞の２〜ｎ個のサブ集団を含んでなるポリクローナル細胞系統であって、各サブ集団は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つの個別の抗体メンバーを発現し、細胞は、ゲノムに無作為かつ安定に組み込まれた１つの個別の抗体メンバーをコードする少なくとも１つの発現構築物を含んでなり、ここで、前記組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個別のメンバーは、本明細書の表３に列挙したＶＨおよびＶＬの対の群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含んでなる抗体分子からなる群から選択される、ポリクローナル細胞系統に関する。本発明はまた、そのようなポリクローナル細胞系統を培養すること、および上清からポリクローナル抗体を回収することを含んでなる、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を製造するための方法に関する。]
[0007] 表３の抗体は、ＲＳＶ感染に暴露され、そしてＲＳＶに対する免疫応答を惹起した健康なドナーから単離された完全なヒト抗体である。従って、表３とは異なる抗体を含んでなるポリクローナル抗体は、ＲＳＶに対するヒトポリクローナル免疫応答を反映する。]
[0008] 本発明は、例えば、医薬組成物に使用するための、１つの容器における組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の商業的な生産を可能にする。本発明の１つの重要な特徴は、製造プロセス中に、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を構成する個々の分子の発現の偏向が低いレベルに保持され、バッチごとの所望されないばらつきを最小限にし、そして製造中のポリクローナル抗ＲＳＶ抗体のメンバーの排除を回避することである。]
[0009] 別の態様では、本発明は、宿主細胞のゲノムへの発現構築物の無作為な組み込みに依存する発現系を使用して特定のモノクローナル抗ＲＳＶ抗体を製造するための細胞系統および方法に関する。]
[0010] 特に、本発明は、表３に列挙した抗体の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体からなる群から選択される抗ＲＳＶ抗体の発現を指令することを可能にする発現構築物を含んでなる細胞であって、ゲノムの無作為な位置に安定に組み込まれた少なくとも１つの発現構築物を含んでなる、細胞に関する。]
[0011] そのような細胞は、前記細胞のゲノムへの無作為な組み込みを可能にする条件下で、前記抗ＲＳＶ抗体をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトすること、および無作為な位置に安定に組み込まれた発現構築物を伴う少なくとも１つの細胞を選択することによって作製してもよく、発現構築物は、表３に列挙した抗体の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体からなる群から選択される抗ＲＳＶ抗体をコードする。]
[0012] 好適な実施形態では、ポリクローナル細胞系統は、ポリクローナル製造細胞系統として使用され、そして凍結および貯蔵され、そしてポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）として使用されるが、このｐＭＣＢのサンプルは、融解し、そしてポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）に使用することができる。モノクローナル抗体の製造のために、モノクローナル細胞系統を使用してマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製し、そこからワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を作製してもよい。]
[0013] 定義
「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。タンパク質は、単量体として、または集成されたポリペプチド鎖、タンパク質のフラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド、もしくはペプチドの２つ以上を含んでなる多量体として、存在することができる。]
[0014] 用語「組み換えポリクローナル抗体の個別のメンバー」は、異なる抗体分子を含んでなる抗体組成物の１つの抗体分子を指し、ここで、各抗体分子は、組成物の他の分子に相同であるが、しかしまた、ポリクローナル抗体の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる可変ポリペプチド配列の１つ以上のストレッチを含有する。]
[0015] 用語「抗体」は、血清の機能的成分を説明し、そしてしばしば、分子（抗体もしくは免疫グロブリン）の集合または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）のいずれかを指す。抗体分子は、特異的抗原決定基（抗原もしくは抗原エピトープ）に結合するか、または反応することが可能であり、次いで、免疫学的エフェクター機構の誘導をもたらし得る。個々の抗体分子は、通常、単一特異性として認識され、そして抗体分子の組成物は、モノクローナル（即ち、同一の抗体分子よりなる）であってもよく、あるいはポリクローナル（即ち、同じ抗原または個別の異なる抗原上の同じもしくは異なるエピトープと反応する異なる抗体分子よりなる）であってもよい。各抗体分子は、それが、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特な構造を有し、そしてすべての天然の抗体分子は、２つの同一な軽鎖および２つの同一な重鎖という全体的に同じ基本構造を有する。抗体はまた、総体的に免疫グロブリンとしても公知である。本明細書において使用する用語、抗体はまた、キメラおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントのような抗体の結合性フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのような多量体形態を含むことが意図される。]
[0016] 用語「ポリクローナル抗体」は、同じもしくは異なる抗原上の異なる複数の特異的抗原決定基に結合または反応することが可能な異なる抗体分子の組成物を説明する。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、ポリクローナル抗体のいわゆる可変領域に局在すると考えられる。しかし、本発明に関して、多クローン性はまた、例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、またはマウスアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＡのような２つ以上の抗体アイソタイプを含有する抗体の混合物の場合におけるようないわゆる定常領域に存在する個々の抗体分子間の差異を説明するものと理解することができる。]
[0017] 用語「免疫グロブリン」は、一般に、血液または血清において見出される抗体の混合物の集合的名称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すために使用してもよい。]
[0018] 用語「免疫グロブリン分子」は、例えば、免疫グロブリンの一部、または任意のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体組成物の部分である個々の抗体分子を示す。]
[0019] 用語「変異体核酸分子のライブラリー」は、「組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体」を総体的にコードする核酸分子の集合を説明するために使用される。トランスフェクションに使用する場合、変種核酸分子のライブラリーは、発現ベクターのライブラリーに含有される。そのようなライブラリーは、典型的に、少なくとも３、５、１０、２０、５０、１０００、１０４、１０５もしくは１０６の個別のメンバーを有する。]
[0020] 本明細書において使用する用語「個別の核酸配列」は、抗ＲＳＶ抗体を共に構成する異なるポリペプチド鎖をコードし得る核酸配列であると理解すべきである。個別の核酸配列が２つ以上のコーディング配列からなる場合、これらの配列は、ジシストロン性転写単位の形であってもよく、または適切なプロモーターに作動可能に連結される場合、それらは、２つの個別の転写単位として作動してもよい。同様に、選択マーカーが、抗体またはそのサブユニットをコードする核酸と共に転写単位に含まれる場合、トリシストロン性およびクアトロシストロン性転写単位を使用することも考えられる。好ましくは、本発明の個別の核酸配列は、例えば、ベクターのような核酸分子の部分である。細胞に導入する場合、完全に集成された抗体を共にコードする遺伝子が同じベクターに存在し、それ故、１つの核酸配列において共に連結される。]
[0021] 本明細書において使用する用語「ベクター」は、異なる遺伝子環境間の輸送のため、および／または宿主細胞における発現のために、核酸配列を挿入することができる核酸分子を指す。ベクターが、ベクターに挿入された核酸配列の転写のための調節エレメント（少なくとも適切なプロモーター）を担持する場合、本明細書においてベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。本明細書において、「ファージミドベクター」および「ファージベクター」は、同義的に使用される。用語「プラスミド」および「ベクター」は同義的に使用される。本発明は、等価な機能を供給するような他の形のベクター、例えば、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノム、または適切な宿主において所望されるタンパク質の産生を指令することが可能な任意の核酸分子を含むことが意図される。]
[0022] 用語「ベクターのライブラリーの各メンバー」は、ベクターのライブラリーから誘導される個別の核酸配列を伴う個々のベクター分子を説明するために使用され、核酸配列は、組み換えポリクローナル抗体の１つのメンバーをコードする。]
[0023] 用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡを細胞に導入するための広範な用語として、本明細書において使用する。用語はまた、例えば、形質転換、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞との融合のような外来ＤＮＡを細胞に導入するための他の機能的に等価な方法を含むことを意味する。]
[0024] 用語「選択」は、特徴を獲得していない細胞との隔離を可能にするような所定の特徴を細胞が獲得している方法を説明するために使用される。そのような特徴は、細胞障害性薬剤に対する耐性、または必須栄養素、酵素、もしくは色の産生であり得る。]
[0025] 用語「選択可能なマーカー遺伝子」、「選択マーカー遺伝子」、「選択遺伝子」および「マーカー遺伝子」は、抗ＲＳＶ抗体をコードする遺伝子と共に細胞に同時導入される選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、所定の抗生物質のようないくつかの細胞障害性薬に対する耐性を付与する遺伝子、増殖培地から枯渇することのある必須栄養素を産生することが可能な遺伝子、解析可能な代謝物を産生する酵素をコードする遺伝子または例えば、ＦＡＣＳによって分取することができる着色タンパク質をコードする遺伝子）を説明するために使用される。]
[0026] 用語「組み換えタンパク質」は、タンパク質のコーディング配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクトされた細胞系統から発現されるタンパク質を説明するために使用される。]
[0027] 本明細書において使用する用語「作動可能に連結する」は、セグメントが他のセグメントと連結され、相手のセグメントと機能的関係に配置される場合を指す。例えば、シグナル配列をコードするＤＮＡは、それが、ポリペプチドの小胞体への移動に参加するリーダーとして発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。また、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合、コーディング配列に作動可能に連結される。]
[0028] 用語「プロモーター」は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼに結合することに関与するＤＮＡの領域を指す。]
[0029] 用語「頭−頭型プロモーター」は、プロモーターによって駆動される２つの遺伝子フラグメントの転写が対向する方向で生じるように近接に配置されているプロモーター対を指す。頭−頭型プロモーターはまた、２つのプロモーターの間の関連しない核酸からなるスタッファーで構築することもできる。そのようなスタッファーフラグメントは、５００を超えるヌクレオチドを容易に含有することができる。]
[0030] 「抗生物質耐性遺伝子」は、抗生物質が細胞に及ぼす阻害または毒性効果を克服することができ、抗生物質の存在下で細胞の生存および増殖の継続を確実にするタンパク質をコードする遺伝子である。]
[0031] 用語「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ｍＲＮＡの正常な５’キャップ構造とは異なる構造を説明する。両方の構造とも、翻訳を開始するＡＵＧコドンがあるため、走査を開始するにあたってリボソームによって認識され得る。１つのプロモーター配列および２つの開始ＡＵＧを使用することによって、第１および第２のポリペプチド配列を、単一のｍＲＮＡから翻訳することができる。それ故、単一の２シストロン性ｍＲＮＡからの第１および第２のポリヌクレオチド配列の共翻訳を確実にするために、ＩＲＥＳ配列より下流のポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列を含むリンカー配列を介して第１および第２のポリヌクレオチド配列を、転写融合することができる。この場合、転写された２シストロン性ＲＮＡ分子が、２シストロン性ＲＮＡ分子のキャップ化５’末端および内部ＩＲＥＳ配列の両方から翻訳され、それによって、第１および第２のポリペプチドの両方を産生する。]
[0032] 用語「誘導発現」は、発現が生じるためにインデューサー分子の相互作用またはコリプレッサー分子および調節タンパク質の放出を必要とする発現を説明するために使用される。]
[0033] 用語「構成性発現」は、通常、誘導性ではない発現を指す。]
[0034] 用語「スクランブル」は、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー由来の異なる２つのポリペプチド鎖からなるポリクローナルタンパク質の２つ以上の個別のメンバーが１個の細胞から発現される状況を説明している。この状況は、１個の細胞が、ゲノム、１対を超える遺伝子セグメントに組み込まれている場合に生じ得て、ここで、遺伝子セグメントの各対は、ポリクローナルタンパク質の個別のメンバーをコードする。そのような状況では、遺伝子セグメントから発現されるポリペプチド鎖の意図されない組み合わせが作製され得る。これらの意図されない組み合わせのポリペプチド鎖は、何ら治療効果を有し得ない。]
[0035] 用語「ＶＨ−ＶＬ鎖スクランブル」は、上記で定義したスクランブルの例である。この例では、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子セグメントは、１対の遺伝子セグメントを構成する。スクランブルは、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの意図されない組み合わせが細胞から産生される場合に生じ、ここで、ＶＨおよびＶＬをコードする２つの異なる遺伝子セグメント対が、同じ細胞に組み込まれる。そのようなスクランブル化抗体分子は、本来の特異性を保持しない可能性があり、それ故、何ら治療効果を有し得ない。]
[0036] 用語「組み換えポリクローナルを製造する細胞系統」は、組み換えポリクローナルを製造する細胞系統を共に構成する個々の細胞が、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つのメンバーをコードする個別の核酸配列の１つ以上のコピーを担持し、そして１つ以上のコピーが各細胞のゲノムに組み込まれるように、変異体核酸配列のライブラリーでトランスフェクトされるタンパク質発現細胞の集団を指す。組み換えポリクローナルを製造する細胞系統を構成する細胞は、例えば、抗生物質選択によって、組み込まれた個別の核酸配列を保持するそれらの能力について選択される。そのような製造細胞系統を構成することができる細胞は、例えば、細菌、真菌、真核細胞、例えば、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に、不死哺乳動物細胞系統、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、および不死化ヒト細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６であり得る。]
[0037] 用語「バイアス」は、組み換えポリクローナルタンパク質産生中の現象を示すために使用され、ここで、ポリクローナルベクター、ポリクローナル細胞系統、またはポリクローナルタンパク質の組成は、無作為な遺伝子変異、個々の細胞間の増殖速度論の差異、異なる発現構築物配列間の発現レベルの差異、またはＤＮＡのクローニング効率の差異により、経時的に変化する。]
[0038] 用語「ＲＦＬＰ」は、「制限酵素断片長多型」、制限酵素による切断後、核酸分子フラグメントの泳動ゲルパターンが解析される方法を指す。]
[0039] 用語「５’ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域を指す。]
[0040] 用語「部位特異的組み込みを回避する条件」は、部位特異的組み込みを得るために可能な方法のいずれをも含まないトランスフェクションプロセスを指す。部位特異的組み込みは、例えば、リコンビナーゼと、宿主細胞の染色体におけるリコンビナーゼの認識部位との組み合わせを使用して、達成することができる。リコンビナーゼはまた、染色体の特定の部位を認識するヌクレオチドストレッチに共有結合させてもよい。部位特異的組み込みもまた、より低い効率ではあるが、相同組み換えを使用して、達成することができる。組み込みベクターを使用する場合、部位特異的組み込みを回避することにより、しばしば、宿主細胞のゲノム全体を通して、無作為な位置に組み込みが生じる。]
[0041] 用語「無作為な組み込み」は、宿主細胞のゲノムへの無作為な位置での発現ベクターの組み込みを指す。無作為の辞書的な意味は、各項目について、この場合、組み込み部位について、可能性が等しいことである。細胞をトランスフェクトする場合、染色体のいくつかの部分は、他の部分よりも組み込み事象を受けやすい傾向があるため、すべての組み込み部位が、絶対的に等しい組み込みの可能性を示すわけではない。特定の組み込み部位に発現ベクターを誘導するための処置を何ら行わない場合、発現ベクターは、可能な組み込み部位のグループ内の無作為な位置に組み込まれる。従って、本発明に関して、「無作為な組み込み」とは、予め決定された位置に発現構築物を誘導するための処置が何ら行われないトランスフェクション手順であると理解すべきである。予め決定された位置に発現ベクターを誘導するための手段がなければ、「無作為な組み込み」を確実にするのに十分である。それによって、組み込み部位は、トランスフェクトされた集団において細胞ごとに異なり、そして正確な組み込み部位は、予測不能であるとみなすことができる。]
[0042] 用語「安定に組み込まれた」は、宿主細胞のゲノムへの発現ベクターの組み込みを指し、ここで、組み込みは、少なくとも２０、より好ましくは３０、より好ましくは４０、より好ましくは５０、７５のような、例えば１００世代以上を超えて安定を保持する。]
[0043] 略語：「ＣＭＶ」＝（ヒト）サイトメガロウイルス。「ＡｄＭＬＰ」＝アデノウイルス主要後期プロモーター。ＳＶ４０ポリＡ＝シミアンウイルス４０ポリＡシグナル配列。ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。ＴｃＲ＝Ｔ細胞受容体。ＥＬＩＳＡ＝酵素免疫測定法。ＬＴＲ＝長末端反復。]
図面の簡単な説明

[0044] ポリクローナル細胞バンクを作製するためのプロセスの略図。図は、ポリクローナル細胞バンク、例えば、ポリクローナルマスター細胞バンクを得るのに必要な工程を図式的に例示する。ａ）は、異なる発現ベクターＡｂ．１、Ａｂ．２、Ａｂ．３などを例示し、それぞれが、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の異なるかつ個別のメンバーをコードする。ｂ）は、発現ベクターでトランスフェクトしようとする宿主細胞を例示する。ｃ）は、個々の細胞において、異なる位置および異なるコピー数での発現ベクターの組み込みを例示する。ｄ）は、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体のメンバーのそれぞれについての細胞のクローンの選択を例示する。この特定の場合、例示を簡単にするために、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つの個別のメンバーあたりただ１つのクローンを示す。工程ｅ）は、ポリクローナル細胞バンクを作製するために工程ｄ）において選択されたクローンの混合を例示する。
重鎖および軽鎖をコードする原型ベクター。エレメントは以下のとおりである：間にスペーサーエレメント（スタッファー）を伴う２つの同一な頭−頭型ヒトＣＭＶプロモーター、重鎖（ＶＨ＋ＩｇＧ１定常領域）および軽鎖（κ）のコーディング領域、ｂＧＨポリＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列、重鎖および軽鎖のゲノムリーダー、ＩＲＥＳ＋ＤＨＦＲ＝ＥＣＭＶ内部リボソーム進入部位およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ、ｐＵＣ ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製開始点、ｂｌａ，ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子。
Ｅ１Ａ発現ベクターｐＭＬ２９。ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく。エレメントは以下のとおりである：ＣＭＶ＝ヒトＣＭＶプロモーター、Ｅ１ａ＝アデノウイルス５型１３Ｓトランス活性化因子のｃＤＮＡ、ｂＧＨポリＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域、ＳＶ４０ＥＰ＝ＳＶ４０初期プロモーター、Ｎｅｏ＝ｎｅｏ耐性遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域、ＡＭＰ＝アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子。
精製されたＳｙｍ００３抗体８１８−４（レーン２および８）、８１０−７（レーン３および９）、８２４−７（レーン４および１０）、ならびに８２４−１８（レーン５および１１）の還元（レーン２〜５）および非還元状態（レーン８〜１１）下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。１〜８μｇの精製されたタンパク質をゲルに適用した。接尾辞（−４、−７、−７、−１８）は、抗体を発現する細胞のクローンを示す。]
[0045] 組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体発現系
本発明は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の一貫した製造方法を提供する。そのような抗体には、完全抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが含まれる。特に、組み換え治療用ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の大規模製造および産生のために、本発明を使用することができることが考慮される。]
[0046] 本発明の製造方法の主な利点の１つは、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を構成するすべてのメンバーを、１もしくは数個のバイオリアクターまたはそれらの等価物中で産生させることができることである。さらに、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体組成物は、プロセス中に組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を構成する個々のメンバーを分離する必要なく、単一の調製物としてリアクターから精製することができる。本明細書に記載の技術は、一般的に、原則として上限なく、多くの個々のメンバーを有するポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を産生させることができる。]
[0047] 使用される宿主細胞系統は、好ましくは、典型的にバイオ医薬品用タンパク質発現に使用される細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のような不死化ヒト細胞を含んでなる哺乳動物細胞系統である。本発明では、ＣＨＯ細胞、より詳細には、改変されたＤＧ４４クローンを使用した。ＣＨＯ細胞は抗体の組み換え製造に広範に使用されるため、およびＤＧ４４クローンは、コードされた遺伝子の増幅をさらに可能にする代謝選択マーカーＤＨＦＲとの組み合わせで使用することができるため、この特定の細胞系統の選択を行った。ＤＧ４４細胞系統を、トランスフェクションによって改変し、そしてサブクローニングした。これは、全体的な収率を増加するために行った。サブクローニングされた細胞系統は、均一な増殖速度および異なる抗ＲＳＶ抗体について均一かつ高い発現レベルを有する細胞クローンを提供する極めて安定な細胞系統である。]
[0048] ＢＨＫ−２１細胞またはＣＨＯのｄｈｆｒ−変異体、例えば、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１もしくはＤＧ４４もしくはＣＨＯ−ＳもしくはＣＨＯ−Ｋ１は、本発明の実践に好適な哺乳動物細胞である。これらの細胞は、当該技術分野において周知であり、そして例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＢＨＫ−２１）またはＤｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１もしくはＤＧ４４）から広範に利用可能である。これらの細胞は、懸濁培養液における増殖に良好に適応し、および／または低い血清濃度下で増殖することができ、そしてＤＨＦＲ選択マーカーと共同して使用することができる。]
[0049] 結果として、当業者であれば、ＤＧ４４クローンの代わりに他のクローンを用いることが可能であり、そしてＣＨＯ細胞の代わりに記載の他の哺乳動物細胞を用いるか、またはなお、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌および細菌を含む他のタイプの細胞を利用することが可能である。それ故、細胞タイプの選択は、本発明を制限することを意図しない。]
[0050] 本発明の組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体は、天然では可変性である異なるが、相同な抗ＲＳＶ抗体分子を含んでなる抗ＲＳＶ抗体組成物を含むことが意図され、これは、好適な実施形態において、抗ＲＳＶ抗体が、天然に存在する多様性を含んでなることを意味する。]
[0051] 最も広範な態様では、ポリクローナル細胞系統は、細胞の２〜ｎ個のサブ集団を含んでなり、各サブ集団は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つの個別の抗体メンバーを発現し、細胞は、ゲノムに無作為かつ安定に組み込まれた１つの個別の抗体メンバーをコードする少なくとも１つの発現構築物を含んでなり、ここで、前記組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個別のメンバーは、本明細書の表３に列挙したＶＨおよびＶＬの対の群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含んでなる抗体分子からなる群から選択される。]
[0052] 表３のＣＤＲ配列を伴う抗体を、ＲＳＶ感染に暴露させた健康な成体から単離した。従って、抗体は、ＲＳＶ感染に対する天然のヒト免疫応答を反映し、そしてこれらの特異的抗体に基づく抗体の組み合わせを作製して、天然のヒト免疫応答を模倣的に表すことができる。]
[0053] 表３由来の抗体の好適な組み合わせは、本明細書に記載の表６中の抗体組成物１〜５６によって構成される。本明細書に記載の表６の抗体の組み合わせのすべてを、１つ以上のＲＳＶ株に対するインビトロ中和について試験したが、その多くが極めて強力であり得る。]
[0054] 個別のメンバーが、本明細書に記載の表６中の抗体組成物２、９、１３、１７、１８、２８、３３、および５６のいずれか１つ、さらになお好ましくは、抗体組成物２８、３３、および５６のいずれか１つにおけるように組み合わされる、抗体の組み合わせが特に好適である。これらの組み合わせは、極めて強力であり、そしてＲＳＶ感染の動物モデルにおいて試験されている。それらは、予防的に投与した場合、肺ウイルス負荷を顕著に減少することが可能である。]
[0055] 他の実施形態では、ポリクローナル抗体の個別のメンバーは、本明細書において定義したクローン７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８６、８８８、ならびに８９４のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる抗体からなる群から選択される。]
[0056] 好適な実施形態では、個別のメンバーは、クローン７９３、８００、８１０、８１６、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５５、８５６、８５８、８６８、８８０、８８８、および８９４由来の抗体、ならびに前記抗体のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される。これらの抗体を、１つ以上のＲＳＶ単離体に対するウイルス中和アッセイにおけるモノクローナル抗体として試験した（表５）。]
[0057] 無作為に組み込まれた発現構築物を含んでなる改変されたＣＨＯ細胞を、クローン８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８５８、８９４、７９３、８１６、８５３、８５５、ならびに８５６のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる次の抗体の発現のために、調製した。これらの抗体を、表６中のいくつかの組み合わせで試験したが、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を作製するのに好適な抗体である。]
[0058] ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体に含めるのに特に好適な抗体は、クローン８２４によってコードされる抗体またはクローン８２４のＣＤＲを伴う抗体；およびクローン８１０によってコードされる抗体またはクローン８１０のＣＤＲを伴う抗体である。]
[0059] 強力な抗ＲＳＶ抗体を得るために、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体は、Ｆタンパク質に結合することが可能な少なくとも１つの個別の抗体分子、およびＧタンパク質に結合することが可能な少なくとも１つの個別の抗体分子を含んでなることが好ましい。より好ましくは、それは、Ｆ−タンパク質を標的にする少なくとも２つの抗体およびＧタンパク質を標的にする２つの抗体を含む。さらにより好ましくは、組成物は、２つの標的タンパク質、ＦおよびＧのそれぞれに対する少なくとも３つの抗体を含んでなる。]
[0060] ポリクローナル抗体は、２つ以上の抗体、好ましくは、３つ以上のような、例えば、４つ以上、５つ以上のような、例えば、６つ以上、７つ以上のような、例えば、８つ以上、９つ以上のような、例えば、１０以上、１５以上のような、例えば、２０以上、２５以上のような、例えば、３０以上、４０以上のような、例えば、５０以上の抗体を含んでなり得る。]
[0061] ポリクローナル抗体中の個別の抗体分子の数が増加すると、最終産物中の各抗体の濃度は減少するため、各抗体は等量で存在するものと想定される。さらに加えて、ポリクローナル細胞系統によって発現される抗体の数が増加すると、製造中に抗体のうちの１つが消失する危険性が増加する。従って、ポリクローナル抗体は、好ましくは、５０未満の抗体、４０未満の抗体のような、例えば、３０未満の抗体、２５未満の抗体のような、例えば、２０未満の抗体またはなお１５未満の抗体を含んでなる。]
[0062] 本発明に関して、ポリペプチド配列の多様性（多クローン性）はまた、例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような２つ以上の異なる抗体アイソタイプを含有する抗体の混合物の場合におけるようないわゆる定常領域または抗体ポリペプチド鎖のＣ領域に存在する個々の抗体分子間の差異を説明するものと理解することができる。それ故、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体は、可変領域（Ｖ領域）もしくは定常領域（Ｃ領域）またはそれらの両方における個々の抗体分子間の配列差異によって特徴付けられる抗体分子を含んでなり得る。好ましくは、以後の精製がかなり容易になるため、抗体は、同じアイソタイプである。例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の抗体はすべて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して共に精製することができるため、これらを組み合わせることもまた考えられる。好適な実施形態では、ポリクローナル抗体を構成するすべての抗体は、精製をさらに容易にするために同じ定常領域を有する。より好ましくは、抗体は、定常領域が同じである重鎖を有する。軽鎖の定常領域もまた、個別の抗体で同じであってもよい。]
[0063] いわゆる定常領域、特に、抗体の重鎖における多クローン性は、抗体の治療応用の点で興味深い。免疫グロブリンの異なるアイソタイプは、自然免疫応答の異なる態様に関与し得る（Canfield and Morrison 1991. J.Exp.Med. 173, 1483-91;Kumpelet al. 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45.-53;Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162）ため、様々な免疫グロブリンアイソタイプは、治療のために抗体を利用する場合、組み合わせることが所望され得る異なる生物学的機能を有する（表１にまとめた）。]
[0064] 表１：ヒト免疫グロブリンアイソタイプの生物学的機能]
[0065] クローン多様性
細胞系統のクローン多様性は、組み換えポリクローナルタンパク質を発現する細胞のプールから単離されたクローンに対するＲＦＬＰによって解析してもよい。（ＲＴ）−ＰＣＲ産物の配列決定により、クローン多様性を解析するもう１つの可能性が示される。多様性はまた、細胞系統によって産生される組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体に対する機能的試験（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって解析することもできる。WO 2006/007853は、ポリクローナル細胞系統およびポリクローナルタンパク質の特徴付けのための方法を開示している。これらの方法は、細胞系統のクローン多様性および得られたポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を解析するために使用することができる。]
[0066] クローンバイアス（即ち、ポリクローナル抗体を構成する個々の抗体の含有量の漸次的な変化）が存在する場合、トランスフェクションに使用された最初のライブラリーのクローン多様性を組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を発現する細胞（細胞系統）のプールにおいて見出される多様性と比較することによって、これを見積もることができる。]
[0067] クローン多様性は、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個々のメンバーの分布として評価してもよい。このような分布は、トランスフェクション中に細胞系統に最初に導入された異なるコーディング配列の数と比較した、最終ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体組成物中の異なる個々のメンバーの総数として、評価することができる。このような場合、トランスフェクションにおいて最初に使用されたコーディング配列の少なくとも５０％が最終ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の異なる個々のメンバーとして同定することができる場合、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％を同定することができる場合、十分な多様性が獲得されたものとみなされる。別の方法で表現すれば、製造中に、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体のうちの１つのメンバーが消失しただけの場合、または２、３、４もしくは５つのメンバーが消失した場合、クローン多様性は十分であるとみなすことができる。]
[0068] 好ましくは、ポリクローナル組成物の個々のメンバーの分布は、個々のメンバー間の共通分布について評価される。このような場合、最終ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体組成物において、全量の７５％を超えるタンパク質を構成する抗ＲＳＶ抗体組成物のメンバーが１つもない場合、十分なクローン多様性が獲得されたものとみなされる。好ましくは、最終ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体組成物中抗体の全量のうち、５０％、なおより好適には、２５％、および最も好適には、１０％を超える個々のメンバーが存在しない。ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体組成物中の個々のメンバーの分布に基づくクローン多様性の評価は、ＲＦＬＰ解析、配列解析およびポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の特徴付けについて後に記載するアプローチのようなタンパク質解析によって、達成することができる。]
[0069] クローン多様性はまた、最終産物において、各抗体の予め定義された相対量を設定することによって、定義してもよい。１０の個別の抗体を伴うポリクローナル抗体では、予め定義された相対量は、各抗体について、例えば、１０％であってもよい。予め決定された相対量はまた、個別の抗体ごとに異なっていてもよい。このとき、産物中の個別の抗体の量と予め定義された相対量との違いが７５％未満の場合、クローン多様性は十分であるということができる。好ましくは、予め決定された相対量との違いが５０％未満、なおより好適には、２５％未満、および最も好適には、１０％未満である。]
[0070] ａ）発現レベルの差異の結果として、ｂ）細胞増殖のばらつきの結果として、生じることがあるクローンバイアスの結果、クローン多様性が減少し得る。そのようなバイアスが生じる場合、クローン多様性の消失のこれらの根源のそれぞれは、本明細書に記載の方法に若干の変更を加えることによって、改善され得る。]
[0071] 細胞系統における個々の細胞の細胞増殖速度のばらつきにより、長期間にわたると、バイアスが組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体発現に導入される可能性があり、細胞系統によって発現される組み換えポリクローナルタンパク質のいくつかのメンバーの存在を増加または減少させる。本方法が、宿主細胞のゲノムへの無作為な組み込みに基づく場合、位置およびコピー数は、両方とも、ポリクローナル細胞系統のメンバー間で異なる。これにより、クローン間で、増殖速度および発現レベルに差異が生じ得る。類似の増殖速度を有する細胞のクローンを選択することによって、この問題は、最小限に抑えられる。さらなる可能性は、ポリクローナルタンパク質の各メンバーに対し、１つを超えるクローンを使用することである。例えば、ポリクローナルタンパク質の単一のメンバーを発現する３〜５の間のクローンが使用される場合、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の各メンバーに１つのクローンのみの場合と比較して、組成物の安定性は増加し得る。]
[0072] 組み換えポリクローナルタンパク質の１つの個別のメンバーを発現する細胞は、好ましくは、１個以上のクローニングされた細胞、２個以上のような、例えば、３個以上、４個以上のような、例えば、５個以上、６個以上のような、例えば、７個以上、８個以上のような、例えば、９個以上、１０個以上のような、例えば、１１個以上、１２個以上のような、例えば、１３個以上、１４個以上のような、例えば、１５個以上、１６個以上のような、例えば、１７個以上、１８個以上のような、例えば、１９個以上、２０個以上のような、例えば、２１個以上、２２個以上のような、例えば、２３個以上、２４個以上のような、例えば、２５個以上、２６個以上のような、例えば、２７個以上、２８個以上のような、例えば、２９個以上、３０個以上のような、例えば、３５個以上、４０個以上のような、例えば、４５個以上、５０個以上のような、例えば、６０個以上、７０個以上のような、例えば、８０個以上、９０個以上のような、例えば、１００個以上から誘導される。ほとんどの目的のためには、クローニングされた細胞の数は、５０個未満、例えば、２０個未満、１５個未満のような、例えば、１０個未満である。]
[0073] この問題に取り組むためのもう１つの方法は、増殖速度、倍加時間、発現レベル、産生レベル、経時的産生の安定性、生存能、抵抗性、頑健性、形態、およびコピー数からなる群から選択される１つ以上の基準に関して、所定の予め設定された限界内で、細胞が均質であることを確実にするために、１つ以上の選択基準を使用することである。]
[0074] 増殖速度のばらつきの１つの理由は、最初のトランスフェクションに使用した開始細胞系統を構成する細胞の集団が異種であることである。細胞系統の個々の細胞は、長期間にわたり、異なって発達することが公知である。より同種の出発物質を確実にするために、発現ベクターによるトランスフェクションの前に、細胞系統から単一細胞レベルへの限界希釈を使用し、そして各単一細胞を細胞の新たな集団にまで増殖させて（いわゆる限界希釈による細胞のサブクローニング）、細胞系統のサブクローニングまたは反復サブクローニングを実施してもよい。]
[0075] 良好に定義された細胞集団を確実にする単一細胞クローニングのための別のおよび好適な方法は、トランスフェクション後、但し、選択手順前に、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用することである。蛍光標識抗体を使用して、ＩｇＧ構築物でトランスフェクトされた細胞のプールから誘導された高産生性細胞を富化することができる（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ２００３． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２７７， １４１−１５５）。ＦＡＣＳ分取を使用することの利点は、この方法が、（単一細胞をウェルに分取することによって）単一細胞クローニングを組み合わせる一方、同時に、各単一細胞の発現レベルに関する情報を提供することである。分取手順をさらに改善するために、死んだかまたは死にかかっている細胞を廃棄するように、生存率染色を含めることができる。ＦＡＣＳ手順により、細胞は、剪断ストレスを含むかなり過酷な条件に供される。これは、間接的に、そのような条件に対する耐性について、細胞が選択されることを意味する。さらに加えて、ＦＡＣＳ手順が自動化され、多数の単一細胞の分取が可能である。]
[0076] また、ＦＡＣＳ方法を使用して、類似のレベルの免疫グロブリンを発現する細胞を分取することができ、それによって、産生性に関して、同種の細胞集団が作製される。同様に、蛍光染料５，６−カルボキシルフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）による標識を使用することによって、類似の増殖速度を示す細胞を、ＦＡＣＳ方法によって選択することができる。]
[0077] 本発明の重要な実施形態は、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の各メンバーに対して１つ以上のクローニングされた細胞系統を作製することである。単一細胞クローンの作製は、多くの標準的な技術のうちのいずれか１つを使用して行ってもよい。しかし、生存能およびＩｇＧレベルについて細胞が選択され、そして個々にウェルに分取されるＦＡＣＳ細胞分取は、一貫して、ポリクローナルワーキング細胞バンクを調製するのに適切な安定なクローンを提供するようになっていることが判明している。個々のクローンは、好ましくは、細胞分取後、選択圧下で培養され、所定の日数後に選択される。クローンが分取後の同じ日に選択される場合、クローンの増殖速度は、比較的均一である。これに加えて、コロニーを目視で調べて、本来の非トランスフェクト細胞系統と比較して、形態が全体的に変化し、増殖速度が低いクローンを廃棄する。最終的に、抗体発現のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の解析技術を使用してアッセイすることができ、そして高くかつ比較的均一な発現レベルを有するクローンを選択することができる。]
[0078] 増殖速度によって誘導されたバイアスが発達する場合であっても、個々のメンバーの消失または過剰出現は、最終組み換えポリクローナルタンパク質産物の多様性要件および経時的な多様性の安定性に依存しており、必ずしも決定的な要因とは限らないかもしれない。]
[0079] 組み換えモノクローナル抗ＲＳＶ製造システム
本発明はまた、所定のモノクローナル抗ＲＳＶ抗体の発現のための細胞系統に関する。ポリクローナル抗体のための細胞系統の確立、細胞の選択、ベクターの設計、クローニングストラテジー、細胞の培養、および抗体の回収について述べることの多くもまた、本発明のモノクローナル態様に関する。]
[0080] 最も広範な「モノクローナル」態様では、本発明は、表３に列挙した抗体の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体からなる群から選択される抗ＲＳＶ抗体の発現を指令することを可能にする発現構築物を含んでなる細胞であって、ゲノムの無作為な位置に安定に組み込まれた少なくとも１つの発現構築物を含んでなる、細胞に関する。]
[0081] そのような細胞は、前記細胞のゲノムへの無作為な組み込みを可能にし、そして無作為な位置で安定に組み込まれた発現構築物を有する少なくとも１つの細胞を選択する条件下で、上に定義した前記抗ＲＳＶ抗体をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトすることによって、作製してもよい。そのような条件下のトランスフェクションにより、しばしば、無作為な位置における宿主細胞のゲノムへの２つ以上の発現構築物の組み込みがもたらされる。]
[0082] 無作為な組み込みを十分に利用するために、発現構築物の増幅を選考し、そしてなおより高い発現レベルを生じる条件下で、トランスフェクションおよび／または選択を行ってもよい。]
[0083] 所定の実施形態では、モノクローナル抗ＲＳＶ抗体は、クローン７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８６、８８８、ならびに８９４のＶＨおよびＶＬ配列対由来のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される。これらのクローンのＶＨおよび軽鎖配列を本明細書に示す。]
[0084] 好適な実施形態では、モノクローナル抗ＲＳＶ抗体は、クローン７９３、８００、８１０、８１６、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５５、８５６、８５８、８６８、８８０、８８８、および８９４由来の抗体、ならびに前記抗体のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される。]
[0085] なおさらに好適には、モノクローナル抗ＲＳＶ抗体は、クローン７９３、８００、８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５８、８８８、および８９４由来の抗体からなる群から選択される。]
[0086] ＣＤＲがクローン８１０由来であるモノクローナル抗体か特に好適であり、そしてＣＤＲがクローン８２４由来であるモノクローナル抗体がなおさらに好適である。両方の抗体とも、優れたウイルス中和効力を示し、そしてまた、ＲＳＶ感染の動物モデルにおいて試験した場合、優れている。]
[0087] 宿主細胞
宿主細胞は、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込むか、またはミニクロモソーム、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＭＡＣ（マウス人工染色体）、またはＨＡＣ（ヒト人工染色体）のような染色体外エレメントを保持することができる任意の細胞から作製することができる。ＭＡＣおよびＨＡＣについては、ＷＯ ９７／４０１８３（本明細書において参考として援用される）に詳細に記載されている。好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞のような哺乳動物細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０もしくはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３のような繊維芽細胞、およびＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のような不死化ヒト細胞が使用される。しかしまた、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのような非哺乳動物の真核または原核細胞を用いることもできる。同じ宿主細胞を、モノクローナル抗体発現およびポリクローナル抗体発現に使用することができる。]
[0088] 本発明の一実施形態では、出発物質として使用すべき細胞系統は、ベクターのライブラリーによるトランスフェクションの前に、細胞系統から単一細胞レベルへのいわゆる限界希釈を実施し、それに続いて、各単一細胞を細胞の新たな集団にまで増殖させることによって、サブクローニングされる。そのようなサブクローニングはまた、所望であれば、正しい細胞系統を選択するプロセスの後半に実施することもできる。単一細胞クローニングのための他の方法として：ＦＡＣＳクローニング（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ２００３． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２７７， １４１−１５５）、ＬＥＡＰＴＭ技術（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）、およびＣｌｏｎｅＰｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ， ＵＫ）が挙げられる。]
[0089] 組み込みのためのベクター
適切なベクターは、適切な選択遺伝子を含んでなる。哺乳動物細胞発現での使用に適切な選択遺伝子として、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）、トリプトファンシンターゼ遺伝子（ｔｒｐＢ）またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓＤ）のような栄養選択を可能にする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、選択マーカーは、ヒポキサンチンおよびチミジン欠損培地により選択することができ、そしてメトトレキサートによりさらに選択することができるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）、ミコフェノール酸により選択することができるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、真核細胞においてＧ４１８により、そして原核細胞においてネオマイシンまたはカナマイシンにより選択することができるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンにより選択することができるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ、ｈｐｈ、ｈｐｔ）遺伝子、ピューロマイシンにより選択することができるピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、またはブラストサイジンにより選択することができるブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（Ｂｓｄ）、ゼオシンおよびブレオマイシンに対する耐性を仲介するゼオシン耐性遺伝子（Ｓｈ ｂｌｅ）のような薬剤耐性を付与する代謝拮抗剤耐性遺伝子である。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）もしくは他の膜タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）のような、例えば、フローサイトメトリーによる分取を可能にするタンパク質をコードする遺伝子もまた、選択マーカーとして使用することができる。]
[0090] 選択マーカーは、個別の発現ベクター上に局在してもよく、それ故、選択マーカーをコードする発現ベクターおよび抗ＲＳＶ抗体または抗ＲＳＶ抗体のサブユニットをコードする１つ以上の発現ベクターによる同時トランスフェクションが実施される。選択マーカーはまた、抗体をコードする発現ベクターに局在してもよい。このような後者の場合、選択マーカーは、好ましくは、抗体またはそのサブユニットの１つをもコードする転写物上に局在する。これは、例えば、ＩＲＥＳ構築物を使用して行うことができる。抗体の場合では、選択マーカーは、好ましくは、例えば、抗体の重鎖のような最も大きなサブユニットをコードする転写物上に局在する。]
[0091] 抗体遺伝子の組み込みのためのベクターは、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つのメンバーをコードするＤＮＡ、その上流に、タンパク質の発現を指令するそれ自体の哺乳動物プロモーターをさらに含んでなる。抗ＲＳＶ抗体の鎖をコードするＤＮＡの上流には、それぞれの鎖の高レベルの発現（二方向性または一方向性）を指令するそれら自体の哺乳動物プロモーターがあり得る。二方向性発現では、発現ベクターにおける頭−頭型プロモーター構成を使用することができ、そして一方向性発現では、２つのプロモーターまたは例えば、ＩＲＥＳ配列と組み合わされた１つのプロモーターを、発現に使用することができる。同じ転写物によってコードされ、そしてＩＲＥＳ配列によって分離される２つの異なるサブユニットを伴う２シストロン性発現ベクターも同様に考えられる。]
[0092] 適切な頭−頭型プロモーター構成には、例えば、両方の配向においてマウスメタロチオネイン−１プロモーターを伴うＡｄＭＬＰプロモーター、両方の配向において伸長因子−１プロモーターを伴うＡｄＭＬＰプロモーター、または両方の配向においてＭＰＳＶプロモーターを伴うＣＭＶプロモーター、または両方の配向において使用されるＣＭＶプロモーターがあるが、これらに限定されない。]
[0093] 抗体の場合、経験から、細胞によって発現される重鎖の量は、軽鎖の量を超えるべきではないことが明らかにされている。従って、軽鎖の発現を指令するプロモーターは、好ましくは、少なくとも、重鎖の発現を指令するプロモーターと同程度に強力である。]
[0094] 機能的リーダー配列をコードする核酸配列は、遺伝子産物を小胞体へ指令するか、またはオルガネラのような細胞内の特定の局在を指令するための発現ベクターに含めることができる。強力なポリアデニル化シグナルを、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’側に配置することができる。ポリアデニル化シグナルは、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化を確実にし、そしてメッセージ安定性に相関する。組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体のメンバーをコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の両方または抗体フラグメントをコードすることができ、場合により、各遺伝子配列の上流に、それら自体の哺乳動物プロモーターエレメントおよび／または下流に、２つの鎖のそれぞれの高レベル発現を指令する強力なポリＡシグナルが存在する。]
[0095] 組み込みのための発現ベクターは、目的の部位における発現の増加のためのエンハンサー、アンチリプレッサー、またはＵＣＯＥ（偏在性クロマチンオープニングエレメント）のようなさらなる転写調節エレメントを担持することができる。エンハンサーは、転写に関与する核内タンパク質と特異的に相互作用する核酸配列である。ＵＣＯＥは、クロマチンを開放するか、またはクロマチンを開放状態で維持し、そして作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする（WO 00/05393およびBenton et al, Cytotechnology 38:43-46, 2002においてより詳細に記載されている)。さらなるエンハンサーとして、例えば、Girod & Mermod 2003(“Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production”, pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV）に記載のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）が挙げられる。アンチリプレッサーエレメントとして、ＳＴＡＲエレメント（Kwaks et al Nat Biotechnol. 2003 May;21(5):553-8）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の１つ以上の調節エレメントが宿主細胞の染色体に組み入れられる場合、それらは、異種調節エレメントと称される。]
[0096] 抗ＲＳＶ抗体の高レベル発現のための発現系の確立
核酸配列を細胞に導入するための方法は、当該技術分野において公知である。これらの方法は、典型的に、細胞、ゲノムまたは染色体外エレメントに目的の配列を導入するためのＤＮＡベクターの使用を含む。細胞のトランスフェクションは、リポフェクション、化学的トランスフェクション（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、ＲＢＣゴースト融合、プロトプラスト融合、ウイルス形質導入などを含む、当業者に公知の多くの方法によって達成され得る。]
[0097] 宿主細胞系統のトランスフェクションでは、各ベクターが、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つのメンバーをコードする核酸配列のただ１つのコピーを含んでなるベクターのライブラリーが使用される。発現ベクターのこのようなライブラリーは、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を総体的にコードする。組み込みのための適切なベクターについては、前のセクションで説明した。]
[0098] 組み換えポリクローナルを製造する細胞系統の作製およびそのような細胞系統からの組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の産生は、いくらかの異なるトランスフェクションおよび製造ストラテジーによって得ることができる。]
[0099] 図１に例示するトランスフェクションの好適な方法は、ライブラリーを構成する個々のベクターを使用して、宿主細胞が個別にトランスフェクトされるハイスループット法である。この方法は個々のトランスフェクションと称される。個々にトランスフェクトされた宿主細胞は、好ましくは、個別に選択される。しかし、それらはまた、選択前にプールしてもよい。選択時に作製される個々の細胞クローンは、発現レベル、増殖速度および組み込みパターンについて解析してもよく、そして好ましくは、類似の増殖速度、類似のコピー数、類似の発現および／または類似の頑健性レベルを伴う細胞クローンを使用して、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体ライブラリーストックを作製してもよい。ストックを作製する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に、個々の細胞クローンを混合して、所望される細胞系統を得ることができる。このアプローチは、組成物の安定性をさらに改善し得る。工程ａ〜ｄを使用して、モノクローナル抗ＲＳＶ抗体の発現のための細胞系統を確立してもよい。] 図１
[0100] 抗ＲＳＶ抗体では、宿主細胞のゲノムへの複数の組み込みを可能にするバルクトランスフェクションにより、サブユニットのスクランブルが生じる。多くの場合、薬学的用途のための組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の製造のように、スクランブルは回避されるべきである。多量体タンパク質では、スクランブルが許容可能である場合、または各宿主細胞のゲノムへのただ１つのコピーの組み込みを確実にする条件下でトランスフェクションが行われる場合、バルクトランスフェクションを行うことができる。そのような方法の例として、レトロウイルス形質導入およびスフェロプラスト融合が挙げられる。]
[0101] ポリクローナル細胞系統の凍結ストックは、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体製造の開始前に作製してもよい。製造のための所望されるポリクローナル細胞系統を得るために、クローンは、凍結ストックを作製する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に混合することができる。]
[0102] 上記で概説した製造ストラテジーにおける共通の特徴は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を構成する個々のメンバーのすべてが、１つの、または限定された数のバイオリアクターのような容器において産生され得ることである。]
[0103] 発現レベルを増加する必要がある場合、遺伝子増幅は、ＤＨＦＲ遺伝子またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子、ｈｐｒｔ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）またはトリプトファンシンテターゼ遺伝子の選択を使用して、実施することができる。これには、そのような選択マーカーを含んでなるベクターを使用する必要がある。本発明の１つの特定の特徴は、細胞の安定性を高く保持するために、コピー数を比較的低く保持することである。従って、細胞は、好ましくは、比較的穏当な選択圧下（例えば、実施例において使用した構築物のタイプでは、低濃度のＭＴＸ（例えば、１〜１０ｎＭ）を伴うヌクレオシドを含まない培地中）で１回の選択に供されるだけである。穏当な選択圧では、極めて高いコピー数を伴う細胞の不安定性を回避する一方、高い発現を生じる平衡化されたコピー数がもたらされると考えられる。]
[0104] より高い発現レベルを達成するために、発現に使用される細胞系統は、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の発現を制御するプロモーターを増強することが可能な異種のトランス活性化因子を含んでもよい。トランス活性化因子およびプロモーターの適切な組み合わせの例を以下に列挙する。]
[0105] ]
[0106] 好ましくは、細胞系統は、トランス活性化因子をコードする発現構築物によりトランスフェクトされ、そしてクローンは、限界希釈または単一細胞クローニングのための他の方法を使用して、選択される。発現ベクターは、本明細書に記載の発現ベクターについて記載のように、プロモーター、選択マーカーなどのようなエレメントを含んでなり得る。好ましくは、トランス活性化因子の発現を制御するプロモーターは、伸長因子１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、メタロチオネイン−１プロモーターなどのような構成性プロモーターである。好適な実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。]
[0107] ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の製造のために、各抗ＲＳＶ抗体メンバーが２つのポリペプチド鎖からなる場合、鎖の組み合わせは、それらが形成する抗ＲＳＶ抗体の親和性、特異性および活性に重要である。この理由のため、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個々のメンバーを構成するポリペプチド鎖は、好ましくは、組み込みに使用される同じベクターに配置され、それによって、それらが、プロセスを通して共に保持されることが確実になる。あるいは、宿主細胞は、重鎖および軽鎖の同族対をコードする発現ベクターの対でトランスフェクトすることができる。]
[0108] 以下の説明は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を発現する細胞系統を入手する仕方の１つの例である。]
[0109] 可変重鎖、およびκまたはλ軽鎖の全体によって囲まれた頭−頭型構築のような、対向する転写方向に配置された２つのプロモーターを有する構成性発現のためのユニバーサルプロモーターカセットを構築してもよく、これは、構築物全体を選択マーカーおよび重鎖定常領域を含んでなるベクターにトランスファーすることを可能にする。誘導発現のためのプロモーターカセットを使用することができることもまた、考慮される。さらに加えて、プロモーターは、対向する方向で転写を生じる尾−尾型または１方向性転写のための尾−頭型に配置することができる。誘導性プロモーターもまた、発現の制御に使用することができる。トランスフェクション後、好ましくは、細胞を、選択条件下で培養して、安定な形質転換体を選択する。]
[0110] 続いて、これらの条件下で生存する細胞を、従来の小さな培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層細胞ファクトリー、小型の高収量バイオリアクター（ＭｉｎｉＰｅｒｍ， ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ）および中空糸型バイオリアクターＷＡＶＥバッグ（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｔａｇｅｌｓｗａｎｇｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に至るスピナーフラスコのような異なる培養形において増殖させることができる。ＥＬＩＳＡを使用して、抗体産生について細胞を試験してもよい。ポリクローナル細胞系統は、好ましくは、長期間の選択圧下での無血清培地中懸濁増殖における生存能について、選択される。]
[0111] 発現系における多クローン性の保存の評価
本発明に従えば、産生中に発現系の多クローン性が重度に変更しないことを確実にし、実際に多クローン性が変更された場合、産生を停止することが可能であることが、しばしば重要である。これは、本発明に従い、変異体核酸配列の相対的発現レベルをモニターすることによって、行われる。例えば、発現レベルは、例えば、ＲＦＬＰ解析、アレイもしくはリアルタイムＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルで、または例えば、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析もしくは様々なクロマトグラフィー技術を使用してタンパク質レベルで、モニターすることができる。これらの技術により、数多くの個々の発現レベルすべてについてベースライン値を確立し、次いで、発現レベルが（全体的におよび相対的の両方で）変化しているかどうかを測定するために、産生中に培養物からサンプルを採取することが可能である。本発明の通常の実践では、ベースライン値周囲の値の範囲を確立することができ、相対的発現レベルが範囲外にあることが認められる場合、産生を終結させる。]
[0112] 細胞の培養および組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の産生
本明細書に記載の方法はまた、本発明のモノクローナル抗ＲＳＶ抗体の製造にも適用する。]
[0113] 上記のように産生されるポリクローナル細胞系統は、細胞のゲノムに挿入された変異体核酸配列によってコードされるポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を発現するのに適切な条件下で、適切な倍地中で増殖させてもよい。細胞培養は、いくつかの工程で実施してもよい。哺乳動物細胞を使用する場合、選択された細胞を、好ましくは、懸濁液における増殖ならびに血清を含まない条件に適応させる。無血清培地における増殖への適応はまた、ポリクローナル細胞系統のためにクローニングされた細胞系統を混合する前に、有利に実施され得る。適応は、１つまたは２つの工程で、および選択圧を伴って、または伴わずに実施することができる。好ましくは、製造された薬品の純度を損なうことなく、製造期間を通して、選択を可能にする選択系が使用される。一般に、薬学的用途のための組み換え抗ＲＳＶ抗体の製造では、最終産物が微量の抗生物質をも含有しないことをバリデートする必要があるため、選択圧を提供するために例えば、抗生物質または他の低分子量薬物を使用しないことが好ましい。]
[0114] ポリクローナル細胞系統が適切な条件に適応する場合、大規模化を開始することができる。この点において、ポリクローナルワーキング細胞ストック（ポリクローナルワーキング細胞バンク、ｐＷＣＢ）および／またはポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）を凍結させることができる。好ましくは、３０〜１００リットルのバイオリアクターが使用されるが、より小さな（５〜１０リットル）またはより大きな（１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００リットルまで、もしくはなおより大きな）バイオリアクターを用いてもよい。適切な産生時間およびバイオリアクターサイズの選択は、バッチからの所望されるタンパク質収量および細胞系統由来の発現レベルに依存する。時間は、２日間から３箇月まで変動してもよい。発現された組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体は、細胞から回収してもよく、または上清から回収してもよい。組み換え抗ＲＳＶ抗体は、当業者に公知の手順に従って、精製および特徴付けを行ってもよい。精製手順の例を以下に列挙する。特徴付け手順の例は、例えば、WO 2006/007853に認められ得る。]
[0115] 培養上清からの組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の精製
培養上清からの抗ＲＳＶ抗体の単離は、タンパク質の物理化学的特性の差異、例えば、分子量の差異、実効電荷、疎水性、または特異的リガンドもしくはタンパク質に対する親和性を利用する様々なクロマトグラフィー技術を使用することで可能である。それ故、タンパク質は、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して分子量に従って、またはイオン交換（カチオン／アニオン）クロマトグラフィーを使用するかもしくは代わりにクロマトフォーカシングを使用して実効電荷に従って、分離してもよい。同様に、タンパク質は、疎水性相互作用を使用する疎水性、あるいは特異的に固定化されたリガンドもしくはタンパク質に対する親和性の差異を利用する電荷誘導クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーに従って、分離してもよい。それ故、抗ＲＳＶ抗体のようなタンパク質の複雑な混合物の精製は、様々なクロマトグラフィー原理の連続的な組み合わせによって達成してもよい。]
[0116] イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用およびゲルろ過のような以後の精製工程と組み合わせたアフィニティークロマトグラフィーが、例えば、細胞培養上清からのＩｇＧ（ポリクローナルならびにモノクローナル）の精製に頻繁に使用されている。分離が、タンパク質と、クロマトグラフィーマトリックスに結合した特異的リガンドとの間の可逆的相互作用に基づくアフィニティー精製は、容易かつ迅速な方法であり、より小さな容積に高い選択性、通常、高能力および濃度を付与する。プロテインＡおよびプロテインＧ、２つの細菌細胞表面タンパク質は、Ｆｃ領域に対して高い親和性を有し、そして固定化された形で、様々な種由来のモノクローナルおよびポリクローナルＩｇＧおよびそのサブクラスの精製ならびに免疫複合体の吸収および精製を含む多くの日常的な用途に使用されている。]
[0117] アフィニティークロマトグラフィー後、下流のクロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換および／または疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施して、宿主細胞タンパク質、漏出したプロテインＡ、およびＤＮＡを取り出すことができる。]
[0118] 最終精製工程としてのゲルろ過を使用して、二量体および他の凝集物のような混入分子を取り出し、そしてサンプルを貯蔵緩衝液に移すことができる。供給源および発現条件によっては、要求されたレベルの抗体純度を達成するためのさらなる精製工程を含む必要があり得る。それ故、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーは、治療用途のための抗体を精製するために、プロテインＡおよびゲルろ過クロマトグラフィーとの組み合わせで、頻回に使用される。]
[0119] 精製を容易にするために、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体のすべてのメンバーは、重鎖および／または軽鎖の同じ定常領域を共有することが好ましい。プロテインＡおよびＧはＩｇＡおよびＩｇＭに結合しないため、他のクラスの抗体を精製するためには、別のアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用しなければならない。免疫親和性精製を使用することができる（固相に結合した抗ＩｇＡまたは抗ＩｇＭモノクローナル抗体）か、あるいは、イオン交換および疎水性相互作用を含む多工程精製ストラテジーを用いることができる。]
[0120] 本明細書において開示したモノクローナル抗体の１つを精製する場合、当該技術分野の方法を用いてもよい。]
[0121] 構造的特徴付け
ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の構造的特徴付けには、混合物の複雑性（クローン多様性およびグリコシル化）のため、高い解像度が必要である。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたは電気泳動のような従来のアプローチは、個々の抗体間を区別するには、十分な解像度を有していないかもしれない。２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）は、複合タンパク質混合物のプロファイリングのために使用されており、続いて、質量分析（ＭＳ）または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ（例えば、プロテオミクス）が行われる。タンパク質の荷電および質量に基づく分離を組み合わせる２Ｄ−ＰＡＧＥは、血清サンプル中のポリクローナル、オリゴクローナルおよびモノクローナル免疫グロブリン間を区別するのに有用であることが証明されている。しかし、この方法にはいくつか制限がある。クロマトグラフィー技術、特に、エレクトロスプレーイオン化ＭＳに結合したキャピラリーおよびＬＣは、複雑なペプチド混合物の解析に適用される機会が増えている。ＬＣ−ＭＳは、モノクローナル抗体の特徴付けに使用されている。極めて複雑なサンプルの解析には、２次元（もしくはそれ以上）での分離によって得ることができるより解像能の高いクロマトグラフィーシステムが必要である。そのようなアプローチは、１次元でのイオン交換、および場合により、ＭＳに結合した２次元での逆相クロマトグラフィー（または疎水性相互作用）に基づき得る。]
[0122] 機能的特徴付け
モノクローナルおよびポリクローナル抗ＲＳＶ抗体は、例えば、同じ標的に対する特異性または類似の活性を有する抗ＲＳＶ抗体による比較研究を介して、機能的に特徴付けることができる。そのような研究は、インビトロならびにインビボで実施することができる。]
[0123] ポリクローナル抗体のインビトロでの機能的特徴付けは、例えば、粗細胞溶解物からの標的抗原の分析的分離のための高度に特異的な技術である免疫沈降であり得る。免疫沈降と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くタンパク質染色（クーマシーブルー、銀染色もしくはビオチン標識）および／またはイムノブロッティングのような他の技術とを組み合わせることによって、例えば、抗原を検出および定量し、それ故、抗体の機能的特性のいくつかを評価することが可能である。この方法は、抗体分子の数またはそれらの結合親和性を評価しないが、それは、標的タンパク質、それ故、特異性を可視化する。この方法は、同様に、発現プロセス中の抗原に対する抗体の潜在的差異（クローン多様性の完全性）をモニターするために使用することができる。]
[0124] モノクローナルまたはポリクローナル抗体のインビボでの機能的特徴付けは、例えば、感染研究であり得る。マウスのような実験動物に、例えば、ＲＳＶを感染させることができ、ＲＳＶに対してポリクローナル抗ＲＳＶ抗体が発達した。感染を抑制することができる程度は、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の機能性を示す。]
[0125] 治療用組成物
本発明の実施形態では、有効成分として組み換えモノクローナルおよびポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を含んでなる医薬組成物は、哺乳動物における疾患の治療または予防を意図しており、好ましくは、薬学的に許容できる賦形剤を伴う。]
[0126] 本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または調合プロセスによる本質的に既知の様式で調製される。薬学的組成物は、従来の薬学的慣例に従って処方してもよい（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA および Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NYを参照のこと）。]
[0127] 好ましくは、有効成分の溶液、およびまた懸濁液、ならびに特に、等張な水溶液または懸濁液が使用され、例えば、有効成分を単独で、またはキャリア、例えば、マンニトールと共に含んでなる凍結乾燥組成物の場合、使用前に、そのような溶液または懸濁液を生成することが可能である。薬学的組成物は、滅菌され得、および／または賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、溶解剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液を含んでなり得、そして本質的に既知の様式、例えば、従来の溶解もしくは凍結乾燥プロセスで調製される。前記溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような増粘物質を含んでなり得る。]
[0128] 注入組成物は、滅菌条件下、慣用の様式で調製され、同じことが、組成物のアンプルまたはバイアルへの導入および容器の密封にも当てはまる。]
[0129] 薬学的組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは、約２０％〜約９０％の有効成分を含んでなり得る。本発明に従う薬学的組成物は、例えば、アンプル、バイアル、坐剤、糖衣錠、錠剤またはカプセルの形態の様な単位剤形であってもよい。]
[0130] 本発明に従う組成物の治療的用途
本発明に従う本発明の方法によって作製される医薬組成物は、哺乳動物におけるＲＳＶ感染の治療、改善または予防に使用してもよい。]
[0131] 本発明の１つの態様は、動物における疾患治療、改善または予防のための方法であり、ここで、有効量の組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体または抗体フラグメントが投与される。]
[0132] 以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。]
[0133] 実施例１ ヒト抗ＲＳＶ抗体のクローニングおよび配列決定
本実施例では、抗ＲＳＶ特異性を有する全長抗体として発現される同族のＶＨおよびＶＬ対を含有するクローンの単離、スクリーニング、選択およびバンキングを例示する。ＳｙｍｐｌｅｘＴＭ同族対クローニング技術（Mejier et al, 2006, J. Mol. Biol, 358:764-772；WO 2005/042774）を使用して、同族対のクローニングおよび連結を行った。ヒト抗ＲＳＶ抗体のクローニング、特徴付け、および機能試験については、同時係属中のPCT/DK2007/000113に記載されている。]
[0134] ドナー
簡単に説明すると、ＲＳＶのシーズン中にＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ ａｔ Ｈｖｉｄｏｖｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （Ｄｅｎｍａｒｋ）の従業員、および入院した小児の患者の両親の中から、合計で８９名のドナーを採用した。１８ｍｌの初回血液サンプルを採取し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製し、そしてＥＬＩＳｐｏｔを使用して、抗ＲＳＶ抗体の存在についてスクリーニングし、そしてＦＡＣＳ解析により形質細胞の頻度を決定した。]
[0135] 初回血液サンプルのスクリーニングにおいて、１１名のドナーが陽性であることが見出され、そしてこれらのうち１０名から４５０ｍｌの２回目の血液サンプルを回収した。形質芽細胞は、分取した単一細胞であり、そしてＥＬＩＳｐｏｔを、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の画分で実施した。]
[0136] ２回目の供血では、全形質細胞集団のうち０．２〜０．６％の間のＲＳＶ特異的形質細胞（ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋）のＥＬＩＳｐｏｔ頻度を有する４名のドナーを同定した。これらの頻度は、同族ＶＨおよびＶＬ対の連結を促進するのに十分高いと考えた。]
[0137] 同族ＶＨおよびＶＬコーディング対の単離
抗体のレパートリーをコードする核酸を、５名のドナー由来の単一細胞に分取された形質細胞から、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲにより単離した。多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲは、重鎖可変領域遺伝子フラグメント（ＶＨ）と全長軽鎖（ＬＣ）との間に物理的連結を作製する。２つのプライマーのセットを、ＶＨ増幅用に１つおよびκＬＣ増幅用に１つを使用することにより、すべてのＶＨ−遺伝子ファミリーおよびκ軽鎖の抗体遺伝子を増幅するためのプロトコルを設計した。逆転写および多重重複伸長ＰＣＲ後、連結された配列を、ネスティドプライマーのセットによる２回目のＰＣＲ増幅に供与した。]
[0138] 各ドナーを個々に処理し、そして多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲにより、１４８０〜２４５０の重複産物を作製した。各ドナー由来の同族の連結したＶＨおよびＶＬコーディング対の作製した集合をプールし、そして哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに挿入した。作製したレパートリーを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、そして２０枚の３８４ウェルマスタープレートに統合し、そして貯蔵した。レパートリーは、１名のドナーあたり１×１０６〜３．６×１０６個のクローンを構成した。]
[0139] 個々の抗体の抗原特異性の特徴付け
スクリーニング中に同定された抗体を、単一のＲＳＶ抗原（組み換えＧタンパク質、組み換えもしくは精製されたＦタンパク質）またはそのペプチドフラグメント（タンパク質Ｇ、サブタイプＡおよびＢの保存領域およびシステインモチーフ、ならびにＳＨタンパク質、サブタイプＡおよびＢの細胞外ドメイン）に対するそれらの結合特異性を、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）により評価することによって、バリデートした。エピトープ特異性を、良好に特徴付けられた市販の抗体（そのうちのいくつかを表２に示す）との競合によって、ＥＬＩＳＡにおいて決定した。表２に示した必ずしもすべての抗体を、本発明の各個々の抗体の特徴付けに使用したわけではない。簡単に説明すると、エピトープのブロッキングに使用した抗体または抗体フラグメントを、大過剰、即ち、実験で決定されたように（Ditzel et al., J. Mol. Biol. 1997, 267:684-695）、７５％の最大結合を与える濃度の１００倍の濃度の固定化抗原（ＲＳＶ Ｌｏｎｇ粒子、ＨｙＴｅｓｔ）と共にインキュベートした。洗浄後、個々の抗体クローンを、様々な濃度でブロックした抗原と共にインキュベートし、そして標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ヤギ−抗ヒトＨＲＰコンジュゲート（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を使用して、結合ヒトＩｇＧを検出した。エピトープ特異性を、ブロッキングおよびプロービング抗体の両方の（実験で決定された）飽和濃度を使用するＢｉａｃｏｒｅにおいて、異なる抗体クローン間の対競合により、さらに特徴付けした。直接アミンカップリング（Ｂｉａｃｏｒｅ）により固定化された精製されたＦまたはＧタンパク質を、抗原として使用した。ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅの両方に基づいたエピトープマッピングにおいて、エピトープブロッキング後の減少した結合を、非競合結合と比較した。]
[0140] 表２：抗Ｆおよび抗Ｇ抗体のエピトープマッピングのためのモノクローナル抗体]
[0141] カラム「抗原」は、Ｍａｂ／Ｆａｂに結合したＲＳＶ関連抗原を示し、サブタイプ特異性が公知である場合、これを（）内に示す。カラム「エピトープ（ａａ）」は、ＭＡｂ／Ｆａｂにより認識されるエピトープの名称を示し、さらに、（）内に、ＲＳＶエスケープ変異体を生じるアミノ酸の位置、または結合が示されたペプチド／タンパク質フラグメントを示す。表２に示す参考文献（Ｒｅｆ．）の番号は：
1. Anderson et al., J. Clin. Microbiol. 1986, 23:475-480.
2. Anderson et al., J. Virol. 1988, 62:1232-4238.
3. Beeler & van Wyke Coelingh, J. Virol. 1989, 63:2941-2950.
4. Crowe et al., JID 1998, 177:1073-1076.
5. Sominina et al., Vestn Ross Akad Med Nauk 1995, 9:49-54.
6. Collins et al., FieldsVirology, p. 1313-1351.
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8. Zhao & Sullender, J. Virol. 2004, 79:3962-3968.
9. Sullender, Virology 1995, 209:70-79.
10. Morgan et al., J. Gen. Virol. 1987, 68:2781-2788.
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14. Walsh et al., J. Gen. Virol. 1989, 70:2953-2961.
15. Walsh et al., J. Gen. Virol. 1998, 79:479-487.
に対応する。]
[0142] さらに加えて、抗体クローンはまた、異なるＲＳＶ株（ＬｏｎｇおよびＢ１）に感染させたヒト咽頭上皮ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣＣＬＬ−２３）への結合についても、ＦＡＣＳにより特徴付けられた。簡単に説明すると、ＨＥｐ−２細胞を、無血清培地において、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６）株またはＲＳＶ Ｂ１（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４００）株のいずれかにかに、０．１ｐｆｕ／細胞の割合で、２４時間（Ｌｏｎｇ株）または４８時間（Ｂ１株）感染させた。剥離および洗浄後、細胞を、９６ウェルプレートに分注し、そして個々の抗ＲＳＶ抗体の希釈液（４ｐＭ〜２００μＭ）と共に、１時間、３７℃でインキュベートした。細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、そして細胞表面結合抗体を、ヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧ−ＰＥコンジュゲート（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）との３０分間、４℃でのインキュベーションによって検出した。モック感染ＨＥｐ−２細胞に対する結合も同様に解析した。タンパク質Ｇ特異的として同定された選択されたクローンもまた、組み換えヒトフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）との交差反応性について、ＥＬＩＳＡにより試験した。抗ヒトＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカインモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、陽性コントロールとして使用した。]
[0143] スクリーニング
ＩｇＧ抗体を含有する上清を、マスタープレート由来の細菌クローンから調製したＤＮＡで一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から入手し、そしてＲＳＶ抗原に対する結合についてスクリーニングした。約６００個の一次ヒット物を、配列決定し、そして整列させた。大部分は、２つ以上のメンバーのクラスターに当てはまったが、いわゆるシングルトンとして１回だけ単離されたクローンも存在した。各クラスター由来の代表的なクローンおよびシングルトンを、バリデーション研究に供した。多くの一次ヒット物を、不対システイン、潜在的なＰＣＲエラーである非保存的変異、多重コドンの挿入および／または欠失、ならびに短縮のような所望されない配列特徴のため、特徴付けから排除した。]
[0144] 合計８５個の独特なクローンがバリデーションを通過した。これらを表３にまとめて示す。各クローン番号は、特定のＶＨおよびＶＬ対を特定する。ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶ遺伝子ファミリーが、各クローンについて示され、そして選択されたクローンのフレームワーク領域（ＦＲ）を特定する。各クローンから発現される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を示すが、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３は、重鎖のＣＤＲ領域１、２および３を示し、そしてＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、軽鎖のＣＤＲ領域１、２および３を示す。]
[0145] 完全な可変重鎖および軽鎖配列は、表３の情報から確立することができる。]
[0146] 表３の個々のカラムについてのさらなる詳細を以下に記載する。]
[0147] ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶ遺伝子ファミリーの名称を、公式のＨＵＧＯ／ＩＭＧＴ命名法（IMGT；Lefranc & Lefranc, 2001, The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press）に従って割り当てた。番号付けおよびアラインメントは、Chothia (Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273:927-48）に従う。クローン８０９は、ＣＤＲＨ１の５’側に２個のコドンの挿入を有し、伸張されたＣＤＲループに翻訳される可能性がある。クローン８３１は、ＣＤＲＨ１の３１位に１個のコドンの欠失を有する。]
[0148] カラム「Ａｇ」は、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはＢｉａｃｏｒｅによって決定されるように、命名されたクローンから産生される抗体により認識されるＲＳＶ関連抗原を示す。「＋」は、クローンがＲＳＶ粒子および／またはＲＳＶ感染細胞に結合するが、抗原が同定されていないことを示す。]
[0149] カラム「エピトープ」は、命名されたクローンから産生される抗体によって認識される抗原部位またはエピトープを示す。「Ｕ」は、エピトープが不明であることを示す。ＵＣＩおよびＵＣＩＩは、不明なクラスターＩおよびＩＩを指す。これらのクラスターに属する抗体は、類似の反応性プロファイルを有するが、現在のところ特定のエピトープに割り当てられていない。いくつかの抗体は、Ａ＆Ｃのような複合的なエピトープを認識する。（）内に示すエピトープは、ＥＬＩＳＡのみで同定されている。]
[0150] ]
[0151] ＣＤＲＨ１と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：２０１〜２８５と同じ順番で記載される。
ＣＤＲＨ２と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：２８６〜３７０と同じ順番で記載される。
ＣＤＲＨ３と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：３７１〜４５５と同じ順番で記載される。
ＣＤＲＬ１と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：４５６〜５４０と同じ順番で記載される。
ＣＤＲＬ２と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：５４１〜６２５と同じ順番で記載される。
ＣＤＲＬ３と称されるカラムの上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：６２６〜７１０と同じ順番で記載される。]
[0152] 結合速度論の特徴付け
組み換えＲＳＶ抗原の結合親和性を、多くの抗体クローンについて、表面プラズモン共鳴によって決定した。全長抗体の酵素切断によって調製したＦａｂフラグメントにより、解析を行った。ピコモル〜ナノモル範囲のＫＤ値を有する多くの高親和性抗体クローンのデータを、表４に示す。市販のパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）から誘導したＦａｂフラグメントを、対照として同様に解析した。]
[0153] 表４：選択されたクローンの速度論的結合定数および親和性]
[0154] 代表的なヒト抗ＲＳＶ抗体の配列
それぞれが単一の同族ＶＨおよびＶＬ遺伝子配列由来の独特な抗体を発現する４４個の選択されたクローン（クローン番号７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８６、８８８、８９４）の全配列（ＤＮＡおよび推定アミノ酸）を、配列番号１〜１７６に示す。]
[0155] ４４個のクローンは、配列番号１〜４４に記載の以下のＶＨ配列を産生することによって特徴付けられる：
クローン番号７３５：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSNGAIGDYDWSWIRQSPGKGLEWIGNINYRGNTNYNPSLKSRVTMSLRTSTMQFSLKLSSATAADTAVYYCARDVGYGGGQYFAMDVWSPGTTVTVSS
クローン番号７３６：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSTQDYVDSVKGRFTISRDNSKNMVYVQMNSLRVEDTAVYYCAKDMDYYGSRSYSVTYYYGMDVWGQGTTVTVSS
クローン番号７４４：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINTSSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAHMELRRLRSDDTAVYYCAREDGTMGTNSWYGWFDPWGQGTLVTVSS
クローン番号７９３：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFPFGDYYMSWIRQAPGKGLEWVAYINRGGTTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAGDTALYYCARGLILALPTATVELGAFDIWGQGTMVTVSS
クローン番号７９５：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGASISSGDYYWSWIRQSPRKGLEWIGYIFHSGTTYYNPSLKSRAVISLDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARDVDDFPVWGMNRYLALWGRGTLVTVSS
クローン番号７９６：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHFGMHWVRQVPGKGLEWVAIISYDGNNVHYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRDDDTGVYYCAKDDVATDLAAYYYFDVWGRGTLVTVSS
クローン番号７９９：
QVQLVESGGGVVQPGRSLKLSCEASGFNFNNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGRNKYFADSVKGRFIISRDDSRNTVFLQMNSLRVEDTAVYYCARGSVQVWLHLGLFDNWGQGTLVTVSS
クローン番号８００：
QVQLVESGGAVVQPGRSLRLSCEVSGFSFSDYGMNWVRQGPGKGLEWVAVIWHDGSNKNYLDSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARTPYEFWSGYYFDFWGQGTLVTVSS
クローン番号８０１：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFNSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIYYEGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARKWLGMDFWGQGTLVTVSS
クローン番号８０４：
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCSASGFTFSNYAMHWVRQAPGKRLEYVSATSTDGGSTYYADSLKGTFTISRDNSKNTLYLQMSSLSTEDTAIYYCARRFWGFGNFFDYWGRGTLVTVSS
クローン番号８１０:
QVQLVQSGAEVKKSGSSVKVSCRASGGTFGNYAINWVRQAPGQGLEWVGRIIPVFDTTNYAQKFQGRVTITADRSTNTAIMQLSSLRPQDTAMYYCLRGSTRGWDTDGFDIWGQGTMVTVSS
クローン番号８１１:
QVQLVQSGAVVETPGASVKVSCKASGYIFGNYYIHWVRQAPGQGLEWMAVINPNGGSTTSAQKFQDRITVTRDTSTTTVYLEVDNLRSEDTATYYCARQRSVTGGFDAWLLIPDASNTWGQGTMVTVSS
クローン番号８１２:
QVQLVQSGAEMKKPGSSVKVSCKASGGSFSSYSISWVRQAPGRGLEWVGMILPISGTTNYAQTFQGRVIISADTSTSTAYMELTSLTSEDTAVYFCARVFREFSTSTLDPYYFDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８１４:
QVQLVESGGGVVQPGKSVRLSCVGSGFRLMDYAMHWVRQAPGKGLDWVAVISYDGANEYYAESVKGRFTVSRDNSDNTLYLQMKSLRAEDTAVYFCARAGRSSMNEEVIMYFDNWGLGTLVTVSS
クローン番号８１６:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSTYAMTWVRQAPGKGLEWVSVIRASGDSEIYADSVRGRFTISRDNSKNTVFLQMDSLRVEDTAVYFCANIGQRRYCSGDHCYGHFDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８１７:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFGFNTHGMHWVRQAPGKGLEWLSIISLDGIKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTVFLQLSGLRPEDTAVYYCAKDHIGGTNAYFEWTVPFDGWGQGTLVTVSS
クローン番号８１８:
QVTLRESGPAVVKPTETLTLTCAFSGFSLNAGRVGVSWIRQPPGQAPEWLARIDWDDDKAFRTSLKTRLSISKDSSKNQVVLTLSNMDPADTATYYCARTQVFASGGYYLYYLDHWGQGTLVTVSS
クローン番号８１９:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSGAISGADYYWSWIRQPPGKGLEWVGFIYDSGSTYYNPSLRSRVTISIDTSKKQFSLKLTSVTAADTAVYYCARDLGYGGNSYSHSYYYGLDVWGRGTTVTVSS
クローン番号８２４:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGNYYWGWIRQPPGKGLEWIGHIYFGGNTNYNPSLQSRVTISVDTSRNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARDSSNWPAGYEDWGQGTLVTVSS
クローン番号８２５:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSNGLSWVRQAPGQGFEWLGWISASSGNKKYAPKFQGRVTLTTDISTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDGGTYVPYSDAFDFWGQGTMVTVSS
クローン番号８２７:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCRVSGHTFTALSKHWMRQGPGGGLEWMGFFDPEDGDTGYAQKFQGRVTMTEDTATGTAYMELSSLTSDDTAVYYCATVAAAGNFDNWGQGTLVTVSS
クローン番号:８２９:
QVTLKESGPALVKATQTLTLTCTFSGFSLSRNRMSVSWIRQPPGKALEWLARIDWDDDKFYNTSLQTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTGIYDSSGYYLYYFDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８３０：
QVQLVQSGAEVKVPGASVKVSCKASGYTFTTYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTYYLQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRGLRSDDTAMYYCARDRVGGSSSEVLSRAKNYGLDVWGQGTTVTVSS
クローン番号８３１：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASANIFTYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINVGNGQTKYSQRFQGRVTITRDTSATTAYMELSTLRSEDTAVYYCARRASQYGEVYGNYFDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８３５：
QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFISYGFSWVRQAPGQGLEWMGWSSVYNGDTNYAQKFHGRVNMTTDTSTNTAYMELRGLRSDDTAVYFCARDRNVVLLPAAPFGGMDVWGQGTMVTVSS
クローン番号８３８：
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSTFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGNKKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQVNSLRVEDTAVYYCAAQTPYFNESSGLVPDWGQGTLVTVSS
クローン番号８４１：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISFGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTDYAQRLQDRVTMTRDTATSTAYLELRSLKSDDTAVYYCTRDESMLRGVTEGFGPIDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８５３：
EVQLVQSGAEVKKPGQSLKISCKTSGYIFTNYWIGWVRQRPGKGLEWMGVIFPADSDARYSPSFQGQVTISADKSIGTAYLQWSSLKASDTAIYYCARPKYYFDSSGQFSEMYYFDFWGQGTLVTVSS
クローン番号８５５：
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYVLTNYAFSWVRQAPGQGLEWLGWISGSNGNTYYAEKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDLLRSTYFDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８５６：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYGFSWVRQAPGRGLEWMGWISAYNGNTYYAQNLQGRVTMTTDTSTTTAYMVLRSLRSDDTAMYYCARDGNTAGVDMWSRDGFDIWGQGTMVTVSS
クローン番号８５７：
EVQLLESGGGLVQPGGPLRLSCVASGFSFSSYAMNWIRLAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPWIDIVVASVISPYYYDGMDVWGQGTTVTVSS
クローン番号８５８：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFDGYTISWLRQAPGQGLEWMGRVVPTLGFPNYAQKFQGRVTVTADRSTNTAYLELSRLTSEDTAVYYCARMNLGSHSGRPGFDMWGQGTLVTVSS
クローン番号８５９：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGSSFSKYGIHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSKKYFTDSVKGRFTIARDNSQNTVFLQMNSLRAEDTAVYYCATGGGVNVTSWSDVEHSSSLGYWGLGTLVTVSS
クローン番号８６１：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKDEVYDSSGYYLYYFDSWGQGTLVTVSS
クローン番号８６３：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSSISASTVLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAKDYDFWSGYPGGQYWFFDLWGRGTLVTVSS
クローン番号８６８：
QVQLQESGPGLVTPSETLSVTCTVSNYSIDNAYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIHHSGSAYYNSSLKSRATISIDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCARDTILTFGEPHWFDPWGQGTLVTVSS
クローン番号８７０：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGEISNTWSTNYNPSLKSRVTISLDMPKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGLFYDSGGYYLFYFQHWGQGTLVTVSS
クローン番号８７１：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRVSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDDSNKQYGDSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMDRLRVEDTAVYYCARASEYSISWRHRGVLDYWGQGTLVTVSS
クローン番号８８０：
QITLKESGPTLVRPTQTLTLTCTFSGFSLSTSKLGVGWIRQPPGKALEWLALVDWDDDRRYRPSLKSRLTVTKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHSAYYTSSGYYLQYFHHWGPGTLVTVSS
クローン番号８８１：
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCEVSGFTFNSYEMTWVRQAPGKGLEWVSHIGNSGSMIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARSDYYDSSGYYLLYLDSWGHGTLVTVSS
クローン番号８８４：
QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGHTFINFAMHWVRQAPGQGLEWMGYINAVNGNTQYSQKFQGRVTFTRDTSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNNGGSAIIFYYWGQGTLVTVSS
クローン番号８８６：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKKTMYLQMNSLRAEDTAVYFCAKTTDQRLLVDWFDPWGQGTLVTVSS
クローン番号８８８：
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGGSINSSNFYWGWIRQPPGKGLEWIGSIFYSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSPVTAADTAVYHCARHGFRYCNNGVCSINLDAFDIWGQGTMVTVSS
クローン番号８９４：
QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFRFSDYGMHWVRQAPSKGLEWVAVIWHDGSNIRYADSVRGRFSISRDNSKNTLYLQMNSMRADDTAFYYCARVPFQIWSGLYFDHWGQGTLVTVSS]
[0156] これらのＶＨアミノ酸配列は、以下の核酸配列によってコードされるクローンに存在し、それらはまた、配列番号４５〜８８として記載される：
クローン番号７３５：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcactgtgtctaatggcgccatcggcgactacgactggagctggattcgtcagtccccagggaagggactggagtggattgggaacataaattacagagggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgtccctacgcacgtccacgatgcagttctccctgaagctgagctctgcgaccgctgcggacacggccgtctattactgtgcgagagatgtaggctacggtggcgggcagtatttcgcgatggacgtctggagcccagggaccacggtcaccgtctcgagt
クローン番号７３６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtacagcgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctcccggcaaggggctggaatgggtggcatttatacggtatgatggaagtactcaagactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaatatggtgtatgtgcagatgaacagcctgagagttgaggacacggctgtctattactgtgcgaaagacatggattactatggttcgcggagttattctgtcacctactactacggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
クローン番号７４４：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcagcggctattatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaacactagcagtggtggcacaaactatgcgcagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcccacatggaactgaggaggctgagatctgacgacacggccgtgtattattgtgcgagagaggacggcaccatgggtactaatagttggtatggctggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号７９３：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcggcctctggattccccttcggtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaagggactggagtgggttgcatacattaatagaggtggcactaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccggggacacggccctctattactgtgcgagagggctaattctagcactaccgactgctacggttgagttaggagcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号７９５：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtgcctccatcagcagtggtgattattactggagttggatccgtcagtctccaaggaagggcctggagtggattgggtacatcttccacagtgggaccacgtactacaacccgtccctcaagagtcgagctgtcatctcactggacacgtccaagaaccaattctccctgaggctgacgtctgtgactgccgcagacacggccgtctattattgtgccagagatgtcgacgattttcccgtttggggtatgaatcgatatcttgccctctggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号７９６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcagcttcagtcactttggcatgcactgggtccgccaggttccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatcatatgatgggaataatgtacactatgccgactccgtaaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagatgacgacacgggtgtgtattactgtgcgaaggacgacgtggcgacagatttggctgcctactactacttcgatgtctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号７９９：
caggtgcagctggtggagtctgggggcggcgtggtccagcctgggaggtccctgaaactctcttgtgaagcctctggattcaacttcaataattatggcatgcactgggtccgccaggcaccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatttcatatgacggaagaaataagtattttgctgactccgtgaagggccgattcatcatctccagagacgattccaggaacacagtgtttctgcaaatgaacagcctgcgagttgaagatacggccgtctattactgtgcgagaggcagcgtacaagtctggctacatttgggactttttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８００：
caggtgcagctggtggagtctgggggagccgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgaagtgtctggattcagtttcagtgactatggcatgaactgggtccgccagggtccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggcatgacggaagtaataaaaattatctagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattccaagaacacattgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtatattactgtgcgaggacgccttacgagttttggagtggctattactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８０１：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattccccttcaatagctatgccatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagtgatatattatgaagggagtaatgaatattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacactctgtatttgcaaatggatagcctgagagccgaggacacggctgtctattactgtgcgaggaagtggctggggatggacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８０４：
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccggcctggggggtccctgagactctcctgttcagcctctggattcaccttcagtaactatgctatgcactgggtccgccaggctccagggaagagactggaatatgtttcagctactagtactgatggggggagcacatactacgcagactccctaaagggcacattcaccatctccagagacaattccaagaacacactgtatcttcaaatgagcagtctcagtactgaggacacggctatttattactgcgcccgccgattctggggatttggaaacttttttgactactggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１０：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtccgggtcctcggtgaaggtctcctgcagggcttctggaggcaccttcggcaattatgctatcaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgggtgggaaggatcatccctgtctttgatacaacaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacagatccacaaacacagccatcatgcaactgagcagtctgcgacctcaggacacggccatgtattattgtttgagaggttccacccgtggctgggatactgatggttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１１：
caggttcagctggtgcagtctggggctgtcgtggagacgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggatacatcttcggcaactactatatccactgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatggcagttatcaatcccaatggtggtagcacaacttccgcacagaagttccaagacagaatcaccgtgaccagggacacgtccacgaccactgtctatttggaggttgacaacctgagatctgaggacacggccacatattattgtgcgagacagagatctgtaacagggggctttgacgcgtggcttttaatcccagatgcttctaatacctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１２：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggctccttcagcagctattctatcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtgggtgggaatgatcctgcctatctctggtacaacaaactacgcacagacatttcagggcagagtcatcattagcgcggacacatccacgagcacagcctacatggagctgaccagcctcacatctgaagacacggccgtgtatttctgtgcgagagtctttagagaatttagcacctcgacccttgacccctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１４：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccgtgagactctcctgtgtaggctctggcttcaggctcatggactatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggattgggtggcagttatttcatatgatggagccaatgaatactacgcagagtccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattcagacaacactctgtatctacaaatgaagagcctgagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgagagcgggccgttcctctatgaatgaagaagttattatgtactttgacaactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１６：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagcctccggattcacctttagtacctacgccatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtcattcgtgctagtggtgatagtgaaatctacgcagactccgtgaggggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctgcaaatggacagcctgagagtcgaggacacggccgtatatttctgtgcgaatataggccagcgtcggtattgtagtggtgatcactgctacggacactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１７：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccaacctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcggcttcaacacccatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtggctgtcaattatctcacttgatgggattaagacccactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctacaattgagtggcctgagacctgaagacacggctgtatattactgtgcgaaagatcatattggggggacgaacgcatattttgaatggacagtcccgtttgacggctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１８：
caggtcaccttgagggagtctggtccagcggtggtgaagcccacagaaacgctcactctgacctgcgccttctctgggttctcactcaacgccggtagagtgggtgtgagttggatccgtcagcccccagggcaggccccggaatggcttgcacgcattgattgggatgatgataaagcgttccgcacatctctgaagaccagactcagcatctccaaggactcctccaaaaaccaggtggtccttacactgagcaacatggaccctgcggacacagccacatattactgtgcccggacacaggtcttcgcaagtggaggctactacttgtactaccttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８１９：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctagtggcgccatcagtggtgctgattactactggagttggatccgccagcccccagggaagggcctggagtgggttgggttcatctatgacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaggagtcgagtgaccatatcaatagacacgtccaagaagcagttctccctgaagctgacctctgtgactgccgcagacacggccgtgtattactgtgccagagatctaggctacggtggtaactcttactcccactcctactactacggtttggacgtctggggccgagggaccacggtcaccgtctcgagt
クローン番号８２４：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcggaaattactactggggctggatccggcagcccccagggaagggacttgagtggattgggcatatctacttcggtggcaacaccaactacaacccttccctccagagtcgagtcaccatttcagtcgacacgtccaggaaccagttctccctgaagttgaactctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagggatagcagcaactggcccgcaggctatgaggactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８２５：
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttctggttacacctttaccagtaatggtctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggtttgagtggctgggatggatcagcgctagtagtggaaacaaaaagtatgccccgaaattccagggaagagtcaccttgaccacagacatttccacgagcacagcctacatggaactgaggagtctgagatctgacgatacggccgtatattactgtgcgaaagatgggggcacctacgtgccctattctgatgcctttgatttctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８２７：
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcagggtttccggacacactttcactgcattatccaaacactggatgcgacagggtcctggaggagggcttgagtggatgggattttttgatcctgaagatggtgacacaggctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacagccacaggcacagcctacatggagctgagcagcctgacatctgacgacacggccgtatattattgtgcaacagtagcggcagctggaaactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８２９：
caggtcaccttgaaggagtctggtcctgcgctggtgaaagccacacagaccctgacactgacctgcaccttctctgggttttcactcagtaggaatagaatgagtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctggagtggcttgcacgcattgattgggatgatgataaattctacaacacatctctgcagaccaggctcaccatctccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacctattactgcgcacggactgggatatatgatagtagtggttattacctctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８３０：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaaggtgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccacttacggtgtcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggttggatcagcgcttacaatggtaacacatactatctacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgcggggcctgaggtctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatcgtgttgggggcagctcgtccgaggttctatcgcgggccaaaaactacggtttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
クローン番号８３１：
caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagttaaggtttcctgcaaggcttctgcaaacatcttcacttatgcaatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgttggcaatggtcagacaaaatattcacagaggttccagggcagagtcaccattaccagggacacgtccgcgactacagcctacatggagctgagcaccctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggcgtgcgagccaatatggggaggtctatggcaactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８３５：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaggcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttcaggttacacctttatcagctatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggagcagcgtttacaatggtgacacaaactatgcacagaagttccacggcagagtcaacatgacgactgacacatcgacgaacacggcctacatggaactcaggggcctgagatctgacgacacggccgtgtatttctgtgcgagggatcgcaatgttgttctacttccagctgctccttttggaggtatggacgtctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８３８：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagccggggacttccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtacgtttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaaataagaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaagtgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtattactgtgcggcccaaactccatatttcaatgagagcagtgggttagtgccggactggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８４１：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttatcagttttggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggacttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacagactatgcacagaggctccaggacagagtcaccatgactagagacacagccacgagcacagcctacttggagctgaggagcctgaaatctgacgacacggccgtgtactattgcactagagacgagtcgatgcttcggggagttactgaaggattcggacccattgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５３：
gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagccggggcagtctctgaagatctcctgtaagacttctggatacatctttaccaactactggatcggctgggtgcgccagaggcccgggaaaggcctggagtggatgggggtcatctttcctgctgactctgatgccagatacagcccgtcgttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcggtactgcctacctgcagtggagtagcctgaaggcctcggacaccgccatatattactgtgcgagaccgaaatattactttgatagtagtgggcaattctccgagatgtactactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５５：
caggttcagctggtgcagtctggacctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttatgtgttgaccaactatgccttcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggctgggatggatcagcggctccaatggtaacacatactatgcagagaagttccagggccgagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagtctgagatctgacgacacggccgtttatttctgtgcgagagatcttctgcggtccacttactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５６：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacaccttttccaactacggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacatactatgcacagaacctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaccacagcctacatggtactgaggagcctgagatctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatggaaatacagcaggggttgatatgtggtcgcgtgatggttttgatatctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５７：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggcccctgaggctctcctgtgtagcctctggattcagctttagcagctatgccatgaactggatccgcctggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattagtggtagcggtggtagcacttactacggagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagagccgtggatcgatatagtagtggcatctgttatatccccctactactacgacggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５８：
caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcctctggaggatccttcgacggctacactatcagctggctgcgacaggcccctggacaggggcttgagtggatgggaagggtcgtccctacacttggttttccaaactacgcacagaagttccaaggcagagtcaccgttaccgcggacagatccaccaacacagcctacttggaattgagcagactgacatctgaagacacggccgtatattactgtgcgaggatgaatctcggatcgcatagcgggcgccccgggttcgacatgtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８５９：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccttgagactctcctgtgcagtgtctggatccagcttcagtaaatatggcatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaaaaagtatttcacagactccgtgaagggccgattcaccatcgccagagacaattcccagaacacggtttttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtctattactgtgcgacaggagggggtgttaatgtcacctcgtggtccgacgtagagcactcgtcgtccttaggctactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８６１：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcatttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaagatgaggtctatgatagtagtggttattacctgtactactttgactcttggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８６３：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacgtttagctcctataccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaagtattagtgctagtactgttctcacatactacgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgagtagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagattacgatttttggagtggctatcccgggggacagtactggttcttcgatctctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８６８：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgacgccttcggagaccctgtccgtcacttgcactgtctctaattattccatcgacaatgcttactactggggctggatccggcagcccccagggaagggtctggagtggataggcagtatccatcatagtgggagcgcctactacaattcgtccctcaagagtcgagccaccatatctatagacacgtccaagaaccaattctcgttgaacctgaggtctgtgaccgccgcagacacggccgtatattactgtgcgcgcgataccatcctcacgttcggggagccccactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８７０：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccttgtccctcacctgcactgtctcaggtgactccatcagtaattactactggagttggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattggagaaatatctaacacttggagcaccaattacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatctctagacatgcccaagaaccagttgtccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtatattactgtgcgagagggcttttctatgacagtggtggttactacttgttttacttccaacactggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８７１：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagagtctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatgacagtaataaacagtatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagagtacgctgtatctgcaaatggacagactgagagtcgaggacacggctgtgtattattgtgcgagagcctccgagtatagtatcagctggcgacacaggggggtccttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８８０：
cagatcaccttgaaggagtctggtcctacgctggtgagacccacacagaccctcacactgacctgcaccttctctgggttctcactcagcactagtaaactgggtgtgggctggatccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttgcactcgttgattgggatgatgataggcgctacaggccatctttgaagagcaggctcaccgtcaccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacatattactgtgcacacagtgcctactatactagtagtggttattaccttcaatacttccatcactggggcccgggcaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８８１：
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtacagcctggaggctccctgagactctcctgtgaagtctccggattcaccttcaatagttatgaaatgacctgggtccgccaggccccagggaaggggctggagtgggtttcacacattggtaatagtggttctatgatatactacgctgactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactatatctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtttattactgtgcgaggtcagattactatgatagtagtggttattatctcctctacttagactcctggggccatggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８８４：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaggaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggacatactttcattaactttgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaggggcttgagtggatgggatacatcaacgctgtcaatggtaacacacagtattcacagaagttccagggcagagtcacctttacgagggacacatccgcgaacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaaacaatgggggctctgctatcattttttactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８８６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcagcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcaaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaaaacgatgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgaagacaacagaccagcggctattagtggactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
クローン番号８８８：
cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccatcggagaccctgtccctcacctgcactgcctctggtggctccatcaacagtagtaatttctactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatcttttatagtgggaccacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagccctgtgaccgccgcagacacggctgtctatcactgtgcgagacatggcttccggtattgtaataatggtgtatgctctataaatctcgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
クローン番号８９４：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtcgtccagcctggaaagtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagattcagtgactacggcatgcactgggtccggcaggctccaagcaaggggctggagtgggtggcagttatctggcatgacggaagtaatataaggtatgcagactccgtgaggggccgattttccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatttgcaaatgaacagcatgagagccgacgacacggctttttattattgtgcgagagtcccgttccagatttggagtggtctttattttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt]
[0157] 同じクローンにおいて、軽鎖の完全なアミノ酸配列（即ち、定常領域および可変領域を含む軽鎖）は以下のアミノ酸配列を有し、それらはまた、配列番号：８９〜１３２として記載される：
クローン番号７３５：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNSHLAWYQQKPGQAPRLLIYNTFNRVTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLATEDFGVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７３６：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQRISNHLNWYQQKPGKAPKLLIFGASTLQSGAPSRFSGSGSGTDFTLTITNVQPDDFATYYCQQSYRTPPINFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７４４：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSLSTWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７９３：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITGYLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７９５：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHGASTGATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISTLEPEDFAVYYCQQYGRTPYTFGQGTKLENKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７９６：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLRSDGKTFLYWYLQKPGQSPQPLMYEVSSRFSGVPDRFSGSGSGADFTLNISRVETEDVGIYYCMQGLKIRRTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号７９９：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTFSCRASQSVSSWVAWYQQKPGKAPKLLISEASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSYSGYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８００：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGITDSLAWYQQKPGKAPKVLLYAASRLESGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKSPATFGPGTKVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８０１：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGFNYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALETPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８０４：
EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSVSSGYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASGRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYFGSPYTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１０：
NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKVPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNISPYTFGQGTKLETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１１：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSETVLYTSKNQSYLAWYQQKARQPPKLLLYWASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLAISSLQAEDVAVYYCQQFFRSPFTFGPGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１２：
EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVSSSYIAWYQQKPGQAPRLVIYAASRRATGVPDRFSGSGSATDFTLTISRLEPEDLAVYYCQHYGNSLFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１４：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSRLAWYQQQPGKAPKFLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLATYYCQQYNRDSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１６：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGRYYVDWYLQKPGQSPHLLIYLASNRASGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLHTPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１７：
EIVMTQSPATLSASPGERATLSCWASQTIGGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGVPARFSGSGSGTEFTLAISSLQSEDFAVYYCQQYKNWYTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１８：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGRAPSLLIYAASNLQSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISGLQPDDFATYYCQQSYSYRALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８１９：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQTPGQAPRLLIYDASYRVTGIPARFSGSGSGIDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８２４：
AIQLTQSPSSLSASVGDTVTVTCRPSQDISSALAWYQQKPGKPPKLLIYGASTLDYGVPLRFSGTASGTHFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８２５：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYNSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIHLASTREYGVPDRFSGSGSGTDFALIISSLQAEDVAVYYCQQYYQTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８２７：
DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQFISSYLHWYQQRPGKAPKLLMYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTNPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８２９：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSYSTRFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８３０：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVTSELAWYQQKPGKAPNFLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８３１：
DIQMTQSPSTLSASVGDRLTITCRASQNIYNWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSLSPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８３５：
DIQLTQSPSFLSASLEDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLLDAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８３８：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８４１：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYWASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTLSSLQAEDVAVYYCQQFHSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５３：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAAGMPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５５：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQAISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQADTFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５６：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSNDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTFSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５７：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNEYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYWGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５８：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDATKLETGVPTRFIGSGSGTDFTVTITSLQPEDVATYYCQHFANLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８５９：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKVPKLLVFAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８６１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIIASYLNWYQQKPGRAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPIFTFGPGTKVNIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８６３：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRTSQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８６８：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIKNNLAWYQVKPGQAPRLLTSGASARATGIPGRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDIAVYYCQEYNNWPLLTFGGGTKVEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８７０：
DIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQRIASYLNWYQQKPGRAPKLLIFAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQSYSTPIYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８７１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLESEVPSRFSGRGSGTDFTFSISSLQPEDIATYFCQQYDNFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８８０：
DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQSYSFPYTFGQGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８８１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPRLTFGGGTKVDITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８８４：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTISVFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSAVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQESFSSSTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８８６：
EIVMTQSPATLSVSPGETATLSCRASQSVSSNLAWYQHKPGQAPRLLIHSASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNMWPPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８８８：
DIVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSLLRTNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSIRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTSITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
クローン番号８９４：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPETFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]

权利要求:

請求項1
細胞の２〜ｎ個のサブ集団を含んでなるポリクローナル細胞系統であって、各サブ集団は、組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の１つの個別の抗体メンバーを発現し、前記細胞は、ゲノムに無作為かつ安定に組み込まれた１つの個別の抗体メンバーをコードする少なくとも１つの発現構築物を含んでなり、前記組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の前記個別のメンバーは、本明細書の表３に列挙したＶＨおよびＶＬの対の群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含んでなる抗体分子からなる群から選択される、ポリクローナル細胞系統。
請求項2
前記個別のメンバーが本明細書の表６中の抗体組成物１〜５６のうちのいずれか１つのように組み合わされる、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項3
前記個別のメンバーが本明細書の表６中の抗体組成物２、９、１３、１７、１８、２８、３３、および５６のいずれか１つ、好ましくは、抗体組成物２８、３３、および５６のいずれか１つにおけるように組み合わされる、請求項２に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項4
前記個別のメンバーが本明細書において定義したクローン７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８６、８８８、ならびに８９４のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる抗体からなる群から選択される、請求項１または２に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項5
前記個別のメンバーがクローン７９３、８００、８１０、８１６、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５５、８５６、８５８、８６８、８８０、８８８、および８９４由来の抗体、ならびに前記抗体のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される、請求項４に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項6
前記個別のメンバーがクローン８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８５８、８９４、７９３、８１６、８５３、８５５、ならびに８５６のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる抗体からなる群から選択される、請求項４に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項7
１つの個別の抗体メンバーがクローン８２４によってコードされる抗体またはクローン８２４のＣＤＲを伴う抗体である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項8
１つの個別の抗体メンバーがクローン８１０によってコードされる抗体またはクローン８１０のＣＤＲを伴う抗体である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項9
少なくとも１つの個別の抗体分子がＦタンパク質に結合することが可能であり、かつ少なくとも１つの個別の抗体分子は、Ｇタンパク質に結合することが可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項10
ｎが３以上である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項11
ｎが３０未満である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項12
前記組み換えポリクローナルタンパク質の１つの個別のメンバーを発現する細胞が１個以上のクローニングされた細胞、２個以上のような、例えば、３個以上、４個以上のような、例えば、５個以上のクローニングされた細胞から誘導される、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項13
各発現構築物が重鎖および軽鎖の両方をコードする、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項14
個別の発現ベクターが重鎖および軽鎖をコードする、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項15
サブユニットの発現が同じまたは同一のプロモーターの制御下にある、請求項１３または１４に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項16
前記発現構築物が選択マーカーをコードする、請求項１３に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項17
前記選択マーカーが抗体または抗体サブユニットをもまたコードする転写物によってコードされる、請求項１６に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項18
組み換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の全てのメンバーが同じアイソタイプである、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項19
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項20
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１に記載のポリクローナル細胞系統。
請求項21
表３に列挙した抗体の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体からなる群から選択される抗ＲＳＶ抗体の発現を指令することを可能にする発現構築物を含んでなる細胞であって、ゲノムの無作為な位置に安定に組み込まれた少なくとも１つの発現構築物を含んでなる、細胞。
請求項22
抗ＲＳＶ抗体がクローン７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８６、８８８、ならびに８９４のＶＨおよびＶＬ配列対由来のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
請求項23
異なるまたは無作為な位置で前記ゲノムに組み込まれた２つ以上の発現構築物を含んでなる、請求項２１に記載の細胞。
請求項24
前記抗ＲＳＶ抗体がクローン７９３、８００、８１０、８１６、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５５、８５６、８５８、８６８、８８０、８８８、および８９４由来の抗体、ならびに前記抗体のＣＤＲを含む抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
請求項25
前記抗ＲＳＶ抗体がクローン７９３、８００、８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８３１、８５３、８５８、８８８、および８９４由来の抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
請求項26
前記ＣＤＲがクローン８１０由来である、請求項２１に記載の細胞。
請求項27
前記ＣＤＲがクローン８２４由来である、請求項２１に記載の細胞。
請求項28
前記細胞が真核細胞である、請求項２１に記載の細胞。
請求項29
前記真核細胞が植物、酵母、真菌、脊椎動物または無脊椎動物からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
請求項30
前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、繊維芽細胞またはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはＰＥＲ．Ｃ６を含む不死化ヒト細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
請求項31
抗ＲＳＶ抗体を発現することが可能な細胞を作製するための方法であって、前記細胞のゲノムへの無作為な組み込みを可能にする条件下で、前記抗ＲＳＶ抗体をコードする発現構築物で細胞をトランスフェクトすること、および無作為な位置に安定に組み込まれた発現構築物を伴う少なくとも１つの細胞を選択することを含んでなり、前記発現構築物は、表３に列挙した抗体の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体からなる群から選択される抗ＲＳＶ抗体をコードする、方法。
請求項32
トランスフェクションおよび／または選択が発現構築物の増幅を選好する条件下で行われる、請求項３１に記載の方法。
請求項33
ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の製造方法であって、ａ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリクローナル細胞系統を提供する工程と、ｂ）前記ポリクローナルタンパク質の発現を可能にする条件下で前記ポリクローナル細胞系統を培養する工程と、ｃ）前記培地から前記ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を回収し、そして場合により精製する工程とを含んでなる、方法。
請求項34
混合された組成物が振盪フラスコ、使い捨てバイオリアクター、およびバイオリアクターからなる群から選択される容器中で培養される、請求項３３に記載の方法。
請求項35
ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個別の抗体メンバーの１つの集団を発現する１つのポリクローナル細胞系統は、１つの容器中で培養され、かつポリクローナル抗ＲＳＶ抗体の個別の抗体メンバーの第２の集団を発現する少なくとも第２のポリクローナル細胞系統は、第２の容器中で培養され、そして精製の前または後に、各容器由来のポリクローナル抗体は混合される、請求項３４に記載の方法。
請求項36
回収しそして場合により精製したポリクローナル抗体における、個別の抗体メンバーのそれぞれの存在を確認する工程をさらに含んでなる、請求項３３に記載の方法。
請求項37
抗ＲＳＶ抗体の製造方法であって、ａ）請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の細胞から誘導される細胞系統を提供する工程と、ｂ）前記抗体の発現を可能にする条件下で前記細胞系統を培養する工程と、ｃ）前記培地から前記抗ＲＳＶ抗体を回収し、そして場合により精製する工程とを含んでなる、方法。
請求項38
前記細胞系統が振盪フラスコ、使い捨てバイオリアクター、およびバイオリアクターからなる群から選択される容器中で培養される、請求項３７に記載の方法。